$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Обогащение окружающей среды, или ЭЭ, относится к изменению параметров жилья для получения благоприятного воздействия на различные заболевания, такие как рак. У мышей с опухолями ЭЭ активирует иммунную систему и уменьшает воспаление, что в конечном итоге улучшает микробиоту кишечника и повышает выживаемость. Чтобы изучить изменения в микробиоте кишечника, добавьте желаемое количество буфера для лизиса стула в пробирку, содержащую стул мыши.
Центрифугируйте образец и перенесите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку. Добавьте буфер для лизиса хлорида гуанидиния, который денатурирует ДНКазу и РНКазу. Далее добавьте этанол и перенесите образец в спиновую колонну с диоксидом кремния.
Этанол помогает ДНК связываться с диоксидом кремния. Центрифугируйте образец. Теперь перенесите колонку в свежую микроцентрифужную пробирку и добавьте в колонку элюирующий буфер для элюирования ДНК.
Центрифугируйте образец и выбросьте колонку. Переложите образец в пробирку для ПЦР и запустите ПЦР для амплификации ДНК. Загрузите ДНК на агарозный гель и выполните электрофорез для количественной оценки размера микробной ДНК. В следующем протоколе мы выделим ДНК из стула, чтобы проанализировать влияние ЭЭ на микробиоту толстой кишки у опухолевых мышей.
- Используйте коммерческий набор для выделения микробной ДНК из стула в соответствии с протоколом обнаружения патогенов в стуле. При этом перенесите образцы из морозильной камеры с температурой минус 80 градусов Цельсия на сухой лед и взвесьте их. Затем настройте ПЦР, которая амплифицирует микробную ДНК, как описано в текстовом протоколе. Затем очистите продукты реакции с помощью магнитных шариков.
Для очистки сначала кратковременно центрифугируйте ампликоновую ПЦР-планшет, чтобы извлечь продукты реакции. Затем сделайте магнитные шарики вихревыми, чтобы равномерно распределить их, и перенесите по 20 микролитров аликвот в каждую реакционную лунку. Тщательно перемешайте шарики с раствором, медленно дозируя весь объем 10 раз. Затем дайте бусинам отстояться в течение 5 минут.
Далее поместите ПЦР-планшет на магнитную подставку и подождите 2 минуты, пока надосадочная жидкость оступится после магнитного сбора шариков. Затем удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Далее, не снимая пластину с магнитом, наполните каждую лунку бусинами 200 микролитрами свежего 80-процентного этанола и подождите 30 секунд. Затем аккуратно удалите надосадочную жидкость.
Повторите этот шаг промывки один раз и дайте бусинам высохнуть на воздухе в течение 10 минут. Теперь вымывайте продукты реакции из шариков, сняв пластину с магнитной подставки и добавив в каждую лунку по 52,5 микролитра Триса. Полностью перемешайте шарики в растворе, медленно пипетируя весь объем 10 раз. Затем соберите шарики на магнитной подставке, как и раньше, и перенесите 50 микролитров надосадочной жидкости на чистую ПЦР-планшет. Накройте тарелку прозрачным клеем и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до одной недели.