Мечение органоидных клеток CRC: метод получения органоидных клеток колоректального рака, трансдуцированных лентивирусом GFP

- Органоиды представляют собой трехмерные клеточные конструкции in vitro, которые самоорганизуются, чтобы имитировать ключевые характеристики тканей органа своего происхождения. Чтобы начать мечение, обработайте собранные органоиды коктейлем протеолитических и коллагенолитических ферментов, чтобы диссоциировать клетки на суспензию. Центрифуга для отделения клеток от надосадочной жидкости, содержащей фермент. Выбросьте надосадочную жидкость. Растворите клеточную гранулу с помощью среды, содержащей лентивирусные векторы. Эти рекомбинантные вирусы несут кодирующую последовательность для зеленого флуоресцентного белка или GFP.

Вирусы сливаются с клетками и высвобождают свой генетический материал и определенные вирусные ферменты в цитоплазму. Вирусная обратная транскриптаза синтезирует комплементарную вирусную ДНК, которая перемещается в ядро хозяина. Вирусная интегразаза помогает включить вирусную ДНК, содержащую последовательность GFP, в геном хозяина. Выращивайте эти трансдуцированные клетки во внеклеточном матриксе или культуральном планшете, покрытом ВКМ. Отсадите среду и центрифугируйте для сбора любых неприкрепленных клеток. Ресуспендируйте элементы в дополнительном ВКМ.

Наложите суспензию на адгезивную культуру, чтобы повысить жизнеспособность клеток. Как только матрица застынет, добавьте питательную среду и инкубируйте, чтобы облегчить образование органоидов. Наблюдайте за культурой под флуоресцентным микроскопом. Трансдуцированные клетки синтезируют зеленые флуоресцентные белки. Органоиды, образованные из этих клеток, проявляют GFP-позитивность. Следующий протокол демонстрирует лентивирусную трансдукцию GFP в клетки органоидов колоректального рака, полученные от пациента.

- Через 7-10 дней культивирования органические элементы отделите механическим способом с помощью стерильного скребка для клеток и перенесите органоиды в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров для их центрифугирования. Затем повторно суспендируйте гранулы в 500 микролитрах PBS с легким постукиванием для еще одного центрифугирования. Чтобы диссоциировать органоиды колоректального рака, добавьте в пробирки 500 микролитров раствора протеолитического и коллагенолитического фермента и перемешайте, слегка постукивая.

Через 10 минут при комнатной температуре добавьте в клетки 500 микролитров среды с добавлением 1% FBS, и очень аккуратно пипетируйте клеточную суспензию несколько раз, чтобы разбить органоиды.

- Бережное пипетирование органоидов CRC человека во время пассирования имеет решающее значение для поддержания неповрежденного сфероидального образования в культуре.

- Снова центрифугируйте клетки и повторно суспендируйте гранулы в 100 микролитрах 5-кратного запаса лентивируса GFP и 400 микролитрах свежей органоидной среды для культур колоректального рака.

- Важно инфицировать органоиды CRC человека высоким титром лентивируса GFP, особенно для достижения почти 100% эффективности заражения.

- Отрегулируйте объем в каждой пробирке так, чтобы получить 5 умножить на 10 до пятой диссоциированной опухолевой клетки на 500 микролитров средней концентрации, и поместите 500 микролитров клеток в каждую лунку из 12-луночного планшета, покрытого искусственным внеклеточным матриксом, как показано на рисунке. После 18 часов в инкубаторе для клеточных культур перенесите плавающие клеточные надосадочные жидкости в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл для центрифугирования с последующей ресуспензией гранул в 70 микролитрах искусственного внеклеточного матрикса на пробирку на льду.

Чтобы повысить жизнеспособность клеток колоректального рака, наложите искусственный внеклеточный матрикс, содержащий опухолевые клетки, на опухолевые органоиды в 12-луночной пластине и поместите планшет в инкубатор для клеточных культур на 30 минут. Когда искусственное покрытие внеклеточного матрикса застынет, скармливают культурам 1 миллилитр свежей питательной среды органоида CRC с добавлением 1% FCS и возвращают клетки в инкубатор для клеточных культур на трое суток. Затем наблюдайте за инфицированными клетками с помощью флуоресцентной микроскопии, чтобы подтвердить почти 100% положительный результат GFP и вернуть клетки в инкубатор еще на 4-6 дней.