JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 5:19 мин • April 30th, 2023
- Начните с создания мыши, находящейся под наркозом условного мутанта с модифицированным геномом, несущим специфические последовательности распознавания фермента Cre-рекомбиназы, называемые вставками LoxP, которые фланкируют желаемый ген-супрессор опухоли, подлежащий мутации. Хирургическим путем обнажают брюшную полость. Найдите дистальный отдел ободочной кишки и зажмите его верхнюю часть. Трансанально введите трубку медицинского назначения и продвигайте ее в дистальный отдел толстой кишки. Промойте толстую кишку физиологическим раствором, чтобы удалить каловые массы. Замените трубку. Зажмите нижнюю область толстой кишки для сегментации. Надуйте сегмент с помощью подходящего раствора для диссоциации клеток. Это перфорирует слизистый барьер и повышает доступность клеток крипты кишечника. Промойте раствор диссоциации.
Далее введите аденовирусную суспензию в сегмент толстой кишки. Эти сконструированные вирусные векторы кодируют ферменты Cre-рекомбиназы. Вирус проникает в клетку, высвобождает свою ДНК в ядро и экспрессирует ферменты. Белки распознают вставки LoxP в геноме хозяина и катализируют сайт-специфическую рекомбинацию, тем самым инактивируя ген-супрессор опухоли. Эта мутация с потерей функции способствует прогрессированию рака. Зашите разрез и дайте мыши восстановиться. Монитор для наблюдения за ростом изолированных колоректальных опухолей. В следующем протоколе показано создание модели мышей колоректального рака с помощью сегментарной адено-кресовой инфекции.
- Начните с того, что поместите мышь под наркозом в положение лежа на спине и нанесите мазь на глаза животного. Заклейте мышь лентой в надежном положении, а затем подтвердите соответствующий уровень седации, ущипнув палец ноги. Сделайте примерно 15-миллиметровый разрез по средней линии на коже нижней части живота. Затем с помощью щипцов захватите мускулатуру брюшной стенки, и осторожно надрежьте мышцу ножницами, чтобы открыть брюшную полость. После выявления дистального отдела ободочной кишки аккуратно зажмите ткань тонким зажимом примерно на 15 миллиметров проксимальнее анального отверстия.
Далее вставьте гибкую тефлоновую трубку трансанально, осторожно продвигая трубку, пока она не достигнет просветной окклюзии, и канюлируйте трубку канюлей 30 калибра. Подсоедините стандартный шприц объемом 1 миллилитр к канюле и промойте толстую кишку несколькими миллилитрами обычного физиологического раствора до тех пор, пока все каловые массы не будут эвакуированы. Как только дистальный отдел толстой кишки опустеет, замените солевую трубку на новую тефлоновую трубку и с помощью второго зажима окклюзируйте толстую кишку примерно на 3 миллиметра дистальнее первого зажима.
С помощью второго шприца объемом 1 миллилитров, оснащенного канюлей 30 калибра, осторожно введите от 50 до 80 микролитров 0,25% трипсина-ЭДТА в зажатый сегмент толстой кишки. Толстая кишка должна раздуваться достаточно, чтобы разрушить слизистый барьер без перфорации зажатого сегмента ткани. Через 10 минут снимите дистальный зажим. Затем удалите трубку с трипсином и промойте дистальный отдел толстой кишки 500 микролитрами обычного физиологического раствора.
После введения новой тефлоновой трубки снова зажмите толстую кишку и накачайте ткань от 50 до 80 микролитров аденовирусного раствора. Через 30 минут снимите зажимы и трубку и закройте брюшную стенку быстро рассасывающимися беговыми швами 6-0. Закройте кожу хирургическими зажимами для ран и наблюдайте за животным на грелке до полного выздоровления.
Чтобы контролировать рост опухоли с помощью колоноскопии, поместите животное, находящееся под наркозом, в положение лежа на спине на грелке, и трансанально введите эндоскоп в кишечный тракт. Аккуратно вдохните воздух под визуальным контролем, чтобы расширить толстую кишку. Затем осторожно сдвиньте эндоскоп вперед до тех пор, пока поражение слизистой оболочки не будет идентифицировано в дистальном отделе толстой кишки, сохраняя каждое эндоскопическое изображение по мере его получения для последующей оценки. Когда все изображения будут получены, медленно снимите эндоскоп и поместите мышь на грелку с температурой 38 градусов Цельсия до полного восстановления.