$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
- Тау-белок локализуется периферически в ядрышке в клетках колоректального рака и помогает поддерживать ядрышковую структуру. В основном, эти клетки экспрессируют гиперфосфорилированный тау-белок, что приводит к резистентности к лекарствам. Таким образом, мы анализируем уровни фосфорилирования тау-белка с помощью анализа фосфатазы.
Начните с взятия клеточного лизата, содержащего общий белок, из клеток колоректального рака человека в двух флаконах, помеченных как тестовый и контрольный. Обработайте исследуемый образец ферментом щелочной фосфатазой. Щелочная фосфатаза удаляет фосфатные группы из тау, в то время как контрольный флакон сохраняет фосфорилированный тау-белок.
Затем запустите образец и контрольный тау на полиакриламидном геле, чтобы разделить белки. Фосфорилированный тау-белок движется медленнее на геле, чем нефосфорилированный тау-белок. Электропромокните образец белка на подходящую мембрану и добавьте первичные антитела, соответствующие как фосфорилированному, так и нормальному тау.
Инкубируйте блотку на ночь. Обработайте блот вторичным антителом, конъюгированным с репортерным ферментом, которое связывается с Fc-областью первичного антитела. Наконец, разработайте блот с использованием хемилюминесцентного субстрата для идентификации тау-белка из общего образца белка, присутствующего в блоте. В следующем протоколе мы продемонстрируем анализ фосфатазы для оценки общего статуса фосфорилирования тау-белка в клетках КРР.
- После подготовки образцов, содержащих 20 мкг общего белка, добавьте в каждый по два микролитра буфера щелочной фосфатазы и по 10 микролитров щелочной фосфатазы. Затем добавьте дистиллированную воду так, чтобы конечный объем каждого образца составил 20 микролитров.
Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Пока образцы инкубируются, готовят дополнительные образцы в той же концентрации, но без фосфатазы для сравнения. Через час остановите реакцию, добавив либо ЭДТА в конечной концентрации 50 мкмоль, либо ортованадат натрия в конечную концентрацию 10 мкмоль
.
Добавьте свежеприготовленный гелевый загрузочный буфер 4X SDS, содержащий 400 миллимолярных DTT. С помощью теплового блока инкубируйте образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. Сделайте образцы вихревыми, а затем дайте им остыть при комнатной температуре в течение 10-15 минут.
Затем загрузите 13 микролитров образца на лунку, а также лестницу молекулярных масс на 10% полиакриламидный гель. Подключите систему электрофореза к источнику питания и установите напряжение на 70 вольт на 20 минут, чтобы переместить образцы белка из укладывающего геля в разрешающий гель.
После этого увеличьте напряжение до 125 вольт и запустите гель в течение примерно 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля. С помощью системы влажного электроблоттинга перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида при напряжении 100 вольт примерно на 100 минут.
Далее инкубируйте мембрану для промокания в 4% бычьем сывороточном альбумине в течение 90 минут при комнатной температуре. Инкубируйте блот в течение ночи в первичном растворе антител при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день промойте кляксу трижды в ПБСТ, каждый раз промывая по семь минут.
Инкубировать в соответствующем растворе вторичного антитела в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем постирайте PBST четыре раза, при этом каждая стирка длится семь минут. Проявите блоттинг с помощью набора для хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя.
Накройте проявленный блот прозрачной пластиковой пленкой, а затем получите хемилюминесцентные изображения блота с помощью коммерчески доступной системы хемилюминесцентной визуализации.