Анализ фосфатазы в клетках КРР: метод изучения статуса фосфорилирования тау-белка в клетках колоректального рака

- Тау-белок локализуется периферически в ядрышке в клетках колоректального рака и помогает поддерживать ядрышковую структуру. В основном, эти клетки экспрессируют гиперфосфорилированный тау-белок, что приводит к резистентности к лекарствам. Таким образом, мы анализируем уровни фосфорилирования тау-белка с помощью анализа фосфатазы.

Начните с взятия клеточного лизата, содержащего общий белок, из клеток колоректального рака человека в двух флаконах, помеченных как тестовый и контрольный. Обработайте исследуемый образец ферментом щелочной фосфатазой. Щелочная фосфатаза удаляет фосфатные группы из тау, в то время как контрольный флакон сохраняет фосфорилированный тау-белок.

Затем запустите образец и контрольный тау на полиакриламидном геле, чтобы разделить белки. Фосфорилированный тау-белок движется медленнее на геле, чем нефосфорилированный тау-белок. Электропромокните образец белка на подходящую мембрану и добавьте первичные антитела, соответствующие как фосфорилированному, так и нормальному тау.

Инкубируйте блотку на ночь. Обработайте блот вторичным антителом, конъюгированным с репортерным ферментом, которое связывается с Fc-областью первичного антитела. Наконец, разработайте блот с