Анализ фосфатазы в клетках КРР: метод изучения статуса фосфорилирования тау-белка в клетках колоректального рака

0 просмотров4:22 мин • April 30th, 2023

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Тау-белок локализуется периферически в ядрышке в клетках колоректального рака и помогает поддерживать ядрышковую структуру. В основном, эти клетки экспрессируют гиперфосфорилированный тау-белок, что приводит к резистентности к лекарствам. Таким образом, мы анализируем уровни фосфорилирования тау-белка с помощью анализа фосфатазы.

Начните с взятия клеточного лизата, содержащего общий белок, из клеток колоректального рака человека в двух флаконах, помеченных как тестовый и контрольный. Обработайте исследуемый образец ферментом щелочной фосфатазой. Щелочная фосфатаза удаляет фосфатные группы из тау, в то время как контрольный флакон сохраняет фосфорилированный тау-белок.

Затем запустите образец и контрольный тау на полиакриламидном геле, чтобы разделить белки. Фосфорилированный тау-белок движется медленнее на геле, чем нефосфорилированный тау-белок. Электропромокните образец белка на подходящую мембрану и добавьте первичные антитела, соответствующие как фосфорилированному, так и нормальному тау.

Инкубируйте блотку на ночь. Обработайте блот вторичным антителом, конъюгированным с репортерным ферментом, которое связывается с Fc-областью первичного антитела. Наконец, разработайте блот с использованием хемилюминесцентного субстрата для идентификации тау-белка из общего образца белка, присутствующего в блоте. В следующем протоколе мы продемонстрируем анализ фосфатазы для оценки общего статуса фосфорилирования тау-белка в клетках КРР.

- После подготовки образцов, содержащих 20 мкг общего белка, добавьте в каждый по два микролитра буфера щелочной фосфатазы и по 10 микролитров щелочной фосфатазы. Затем добавьте дистиллированную воду так, чтобы конечный объем каждого образца составил 20 микролитров.

Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Пока образцы инкубируются, готовят дополнительные образцы в той же концентрации, но без фосфатазы для сравнения. Через час остановите реакцию, добавив либо ЭДТА в конечной концентрации 50 мкмоль, либо ортованадат натрия в конечную концентрацию 10 мкмоль

.

Добавьте свежеприготовленный гелевый загрузочный буфер 4X SDS, содержащий 400 миллимолярных DTT. С помощью теплового блока инкубируйте образцы при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут. Сделайте образцы вихревыми, а затем дайте им остыть при комнатной температуре в течение 10-15 минут.

Затем загрузите 13 микролитров образца на лунку, а также лестницу молекулярных масс на 10% полиакриламидный гель. Подключите систему электрофореза к источнику питания и установите напряжение на 70 вольт на 20 минут, чтобы переместить образцы белка из укладывающего геля в разрешающий гель.

После этого увеличьте напряжение до 125 вольт и запустите гель в течение примерно 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля. С помощью системы влажного электроблоттинга перенесите гель на мембрану из поливинилиденфторида при напряжении 100 вольт примерно на 100 минут.

Далее инкубируйте мембрану для промокания в 4% бычьем сывороточном альбумине в течение 90 минут при комнатной температуре. Инкубируйте блот в течение ночи в первичном растворе антител при температуре 4 градуса Цельсия. На следующий день промойте кляксу трижды в ПБСТ, каждый раз промывая по семь минут.

Инкубировать в соответствующем растворе вторичного антитела в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем постирайте PBST четыре раза, при этом каждая стирка длится семь минут. Проявите блоттинг с помощью набора для хемилюминесценции в соответствии с инструкциями производителя.

Накройте проявленный блот прозрачной пластиковой пленкой, а затем получите хемилюминесцентные изображения блота с помощью коммерчески доступной системы хемилюминесцентной визуализации.

09:22

В пробирке агрегации анализов с помощью гиперфосфорилированного тау-белок

Похожие видео

0 Просмотры

09:49

В пробирке Assay для изучения агрегация белка Тау и наркотиков скрининг

Похожие видео

0 Просмотры

04:59

Колориметрического анализа щелочной фосфатазы деятельность S. aureus биопленки

Похожие видео

0 Просмотры

13:38

Мониторинг киназы и фосфатазы деятельности путем клеточного цикла Логометрический FRET

Похожие видео

0 Просмотры

04:28

Анализ связывания микротрубочек в клетках КРР: метод изучения связывающего микротрубочек тау-белка в клетках колоректального рака

Похожие видео

0 Просмотры

04:14

Анализ с вытягиванием одной молекулы для анализа фосфорилирования белков: высокопроизводительный метод для количественной оценки фосфорилирования белка в клеточном лизате

Похожие видео

0 Просмотры

04:47

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса для выявления множественных фосфорилирований в белках

Похожие видео

0 Просмотры

12:47

Спектроскопии ядерного магнитного резонанса для идентификации нескольких фосфорилирований искробезопасных неупорядоченных белков

Похожие видео

0 Просмотры

12:55

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

Похожие видео

0 Просмотры

08:55

Обнаружение Rab10 фосфорилирования LRRK2 деятельностью с помощью SDS-страницы с тегом фосфат привязки

Похожие видео

0 Просмотры

Последнее обновление: 22 августа 2026