Анализ связывания микротрубочек в клетках КРР: метод изучения связывающего микротрубочек тау-белка в клетках колоректального рака

- Тау — это белок, связанный с микротрубочками, участвующий в стабилизации и сборке микротрубочек. Многие раковые клетки экспрессируют гиперфосфорилированный тау-белок, который не может поддерживать хорошо организованное связывание микротрубочек. Чтобы изучить взаимодействие между тау-белком и микротрубочками, добавьте лизат раковых клеток, содержащий тау-белок, и рабочий раствор микротрубочек в микрофугальную пробирку.

Нефосфорилированные тау-белки, присутствующие в клеточном лизате, связываются с микротрубочками. Теперь добавьте желаемое количество буфера PEM в пробирку, чтобы стабилизировать активность тубулина, белка, который полимеризуется в филаменты с образованием микротрубочек. Инкубируйте смесь в течение нужной продолжительности.

Центрифугируйте смесь, чтобы измельчить белок, связанный с микротрубочками. Несвязанный белок остается в надосадочной жидкости. Переложите надосадочную жидкость в свежую пробирку и повторно суспендируйте гранулу в подходящем буфере. Добавьте гелевый буфер в ресуспендированную суспензию гранул и запустите образцы на полиакриламидном геле, чтобы отделить белок, связанный с микротрубочками, и электроблот на подходящей мембране.

Добавьте подходящие антитела и разработайте блоттинг с использованием хемилюминесцентного субстрата для идентификации связанных тау-белков. В следующем протоколе мы выполним анализ связывания микротрубочек для идентификации белков, связанных с микротрубочками.

- После подготовки свежих образцов инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Ультрацентрифугируйте образцы при температуре 100 000 x g и 25 градусах Цельсия в течение 60 минут. Затем переведите по 120 микролитров каждой надосадочной жидкости, содержащей несвязанный тау, в отдельные чистые и помеченные пробирки. Добавьте 120 микролитров буфера для образца 5X в гранулу, содержащую связанный тау.

После тщательного перемешивания с помощью вортекса и пипетирования переложите смесь в чистые пробирки с маркировкой. После подготовки образцов эквивалентной концентрации белка добавьте свежий гелеобразующий буфер 4X SDS, содержащий 400 мЛ. Дтт. Используйте тепловой блок для инкубации образцов при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут.

Сделайте образцы вихревыми, а затем дайте им остыть при комнатной температуре в течение 10-15 минут. Загрузите 13 микролитров образца в лунку и лестницу молекулярных масс на 10% полиакриламидный гель. Подключите положительный и отрицательный электроды системы электрофореза к источнику питания, а затем установите напряжение на 70 вольт на 20 минут.

После этого увеличьте напряжение до 125 вольт и запустите гель в течение примерно 70-120 минут, пока образцы и белковая лестница не достигнут конца геля. Используйте систему влажного электроблоттинга для переноса геля на мембрану из поливинилиденфторида при напряжении 100 вольт в течение примерно 100 минут. Инкубируйте мембрану до промокания в 4% бычьем сывороточном альбумине в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем инкубируйте в течение ночи в первичном растворе антител при температуре 4 градуса Цельсия.

На следующий день промойте кляксу четыре раза PBST, при этом каждое мытье длится семь минут. Инкубируйте промытый блот в соответствующем растворе вторичных антител в течение 90 минут при комнатной температуре. Затем мойте PBST в течение семи минут, повторяя стирку в общей сложности четыре раза. Проявите блоттинг с помощью набора для хемилюминесценции. Накройте прозрачной полиэтиленовой пленкой и получите изображения с помощью системы хемилюминесцентной визуализации.