Выделение ЦОК из образца цельной крови: метод получения ЦОК из модели колоректального рака у мышей

- Циркулирующие опухолевые клетки, или ЦОК, — это раковые клетки, которые происходят из первичной опухоли и попадают в кровоток. Большинство ЦОК могут выживать в кровотоке, не прикрепляясь к поверхности; Таким образом, мы можем обнаружить их непосредственно из крови большинства больных раком.

ЦОК в крови могут указывать на распространение опухоли внутри организма, поэтому их идентификация помогает понять прогрессирование рака. Начните с взятия мышиной модели под наркозом колоректального рака и получите кровь с помощью пункции сердца. Перелейте кровь в коническую пробирку, содержащую среду с градиентом плотности, и центрифугуйте для разделения компонентов крови.

Отбросьте самый верхний слой, содержащий плазму, и соберите фракцию мононуклеарных клеток периферической крови, или PBMC, присутствующую на границе раздела, в отдельную пробирку. Затем добавьте антитело против EpCAM к клеткам PBMC и наблюдайте под флуоресцентным микроскопом. Циркулирующие ЦОК экспрессируют клеточный маркер, известный как молекула адгезии эпителиальных клеток или EpCAM. Таким образом, антитела против EpCAM могут помочь идентифицировать EpCAM-положительные ЦОК.

Соберите ЦОК и сохраните их для дальнейшего анализа. В следующем протоколе мы идентифицируем EpCAM-экспрессирующие ЦОК из фракции периферических мононуклеарных клеток крови мышиной модели колоректального рака.

- Чтобы изолировать циркулирующие опухолевые клетки в соответствующей экспериментальной конечной точке, заполните 15-миллилитровые конические пробирки 5 миллилитров градиентной среды плотности на пробирку и осторожно перенесите образцы цельной крови, собранные у опухолевидных животных, на слои градиента плотности.

Разделите ячейки центрифугированием и тщательно восстановите границу раздела, содержащую мононуклеарные ячейки. Пипетируйте мононуклеарные ячейки в новую 15-миллилитровую пробирку для второго центрифугирования, за которым последуют две промывки в PBS. После второй промывки повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах PBS с добавлением ЭДТА и добавьте четыре микролитра антител против EpCAM в каждый образец для 20-минутной инкубации на льду в темноте.

Затем с помощью гидрофобной барьерной ручки нарисуйте примерно 1 сантиметр круга в одной стерильной 6-сантиметровой чашке Петри на образец, и добавьте 700 микролитров буфера для сбора в каждый круг, а затем 50 микролитров клеточной суспензии. С помощью микроскопа проверьте плотность клеток и дайте образцам осесть в течение примерно пяти минут. Затем проведите скрининг падения клеток на положительный результат EpCAM и с помощью микроманипулятора перенесите интересующие клетки в 50 микролитров соответствующего буфера для предполагаемого последующего анализа.