Подготовка блоков замороженной кожной ткани: протокол сохранения образцов меланомы кожи мышей

- Неподвижные стволовые клетки меланоцитов в ответ на ультрафиолетовое излучение или депиляцию волос активируются. Активированные стволовые клетки меланомы могут привести к меланоме кожи – форме рака кожи. Для изучения меланомы мы готовим замороженные блоки тканей кожи, чтобы сохранить нативные структуры ДНК и белков во время процедуры фиксации.

Начните с того, что поместите усыпленную мышь с меланомой на хирургическую кровать и удалите шерсть со спинной части кожи над хвостом. Вырежьте кожу и накройте ее фильтровальной бумагой. Затем погрузите фильтровальную бумагу, содержащую кожную ткань, в нейтральный буферный формалин на желаемое время. Формалин проникает в ткани кожи и связывается с аминокислотами, что вызывает сшивку белков, что приводит к фиксации тканей.

Снимите кожную ткань с бумаги и разрежьте ткань, чтобы получить кусочки нужного размера. Теперь вертикально поместите кусочки ткани в криомолд, наполненный средой OCT, и поместите криоформы на сухой лед. ОКТ представляет собой матрикс образца, который затвердевает при замораживании и образует студенистый слой вокруг образца ткани, удерживающий его на месте. Используйте замороженные блоки для дальнейших гистологических анализов. В следующем протоколе мы подготовим блоки замороженной кожной ткани из спинной кожи мыши для изучения меланомы кожи.

- Чтобы изолировать образцы кожи, с помощью электрического триммера удалите волосы с тыльной стороны кожи усыпленных облученных мышей и слегка почистите открытую кожу безворсовой салфеткой, чтобы очистить область. Сделайте небольшой надрез острыми ножницами чуть выше основания хвоста и вставьте в него большие тупые ножницы, чтобы отделить подкожные соединительные ткани. С помощью острых ножниц аккуратно разрежьте по краю интересующей участка кожи, чтобы изолировать образец ткани, и положите иссеченную ткань кожи на чистое бумажное полотенце.

Затем с помощью тупых щипцов растяните кожу так, чтобы она прилипла к полотенцу и была натянута. Когда все образцы будут собраны, поместите образец кожи и подложку из бумажного полотенца в сложенный лист фильтровальной бумаги, непосредственно прилегающий к складке, следя за тем, чтобы образец был гладким, а не сложенным или скомканным. Закройте боковые стороны фильтровальной бумаги скобами и обрежьте бумагу. Затем полностью погрузите образцы в 10% нейтральный буферный формалин на 3-5 часов при комнатной температуре, прежде чем промыть ткани двумя 5-минутными промывками в деионизированной воде.

После второй промывки аккуратно удалите остатки материала с тканей кожи и обрежьте края образца, чтобы они не были зазубрены. Далее сделайте по три сагиттальных надреза в каждом образце так, чтобы ширина полосок была не более 5 миллиметров и сделайте поперечные надрезы так, чтобы ширина образцов была не более 20 миллиметров. Расположите криомолд, содержащий оптимальную температуру резки или среду ОКТ, в портретной ориентации и поместите четыре-пять кусков кожи поверх ОКТ.

Когда все детали будут на своих местах, используйте две пары тонких щипцов, чтобы подвести длинный край каждого кусочка кожи к нижней части криомолда так, чтобы образцы находились вертикально внутри ОКТ и перпендикулярно основанию формы. Затем заполните форму дополнительным ОКТ до второй кромки и поместите форму на плоскую поверхность куска сухого льда, используя щипцы для корректировки любых кусочков кожи, которые могли сместиться во время переноса, когда блок начинает замерзать по мере необходимости.