Создание органотипических полнокожных реконструкций: процедура создания 3D-модели кожи с использованием образцов кожи человека

Кожа в основном состоит из верхнего эпидермального слоя и нижнего дермального слоя. Эпидермальные клетки расслаиваются на несколько слоев, начиная от наименее дифференцированных клеток, присутствующих в основании, и заканчивая высокодифференцированными клетками на периферии. Чтобы вырастить ткань кожи, имитирующую морфологические и биохимические аспекты нормальной кожи, мы можем создать органотипическую модель кожи.

Для начала возьмите многолуночный планшет с мембранным вкладышем. Добавьте во вставку дермальные фибробласты, смешанные с коллагеном. Инкубируйте для облегчения затвердевания коллагенового матрикса, чтобы внедрить фибробласты и имитировать дермальный отсек кожи.

Далее добавьте суспензию клеток кератиноцитов поверх дермального слоя. Инкубируйте планшет, чтобы позволить кератиноцитам прилипнуть к дермальному компартменту. Дополните культуру средой для эпидермализации, чтобы инициировать пролиферацию кератиноцитов и формирование эпидермального слоя.

Наконец, переложите вкладыши в свежую многолуночную пластину. Добавьте среду для расслоения таким образом, чтобы она покрывала только основание конструкции, тем самым создавая границу раздела воздух-жидкость. После инкубации воздушно-жидкостная граница раздела облегчает дифференцировку кератиноцитов в многослойный эпидермис.

В следующем протоколе мы создадим 3D-органотипические реконструкции кожи, имеющие дермальные и эпидермальные аналоги из изолированных клеток кожи человека.

Чтобы создать дермальный аналог реконструированной кожи, поместите мембранные вставки размером 8 микрометров в 24-луночный планшет для культивирования клеток. Для каждой вставки ресуспендируйте 100 000 фибробластов в растворе для нейтрализации геля. Далее быстро смешайте суспензию фибробластов с коллагеном 1 типа в соотношении 1:3 в итоговом объеме 500 микролитров без образования пузырьков.

Затем с помощью пипетки добавьте суспензию к каждой вставке. Внутри стерильного капюшона поместите вставки при комнатной температуре без среды на 30 минут, чтобы дермальные гели осели. Далее накройте гели DMEM и выдерживайте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

После ночной инкубации удалите DMEM из дермальных гелей и уравновесьте их с помощью EGM в течение 2 часов при температуре 37 градусов Цельсия для создания эпидермального аналога реконструированной кожи. Далее с помощью пипетки удалите EGM из гелей.

Затем тщательно запечатайте 100 000 кератиноцитов, ресуспендированных в 100 микролитрах EGM, поверх каждого геля. Инкубируйте реконструкцию в течение 1,5 часов при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить кератиноцитам прилипнуть к дермальному гелю. С помощью наконечника пипетки осторожно удалите остатки геля со стенки вставки.

Затем накройте каждую реконструкцию 800 микролитрами EGM и культурой на 7 дней при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

Аккуратно удалите остатки геля со стенки вставки с помощью маленького белого наконечника пипетки.

На 8 день поместите вкладыши в отдельные лунки 6-луночной пластины. Далее добавьте от 1,2 до 1,4 миллилитров метастатической меланомы среды в каждую лунку, чтобы покрыть только основание реконструированной кожи. Затем инкубируйте от 10 до 17 дней при температуре 37 градусов Цельсия в 5% углекислом газе.

• 3D Skin Models - Three-dimensional constructs mimicking natural skin structures
• Human Skin Samples - Biopsy samples of human skin used for scientific study.
• Epidermalization - The process of keratinocyte proliferation and formation of an epidermal layer.
• Organotypic Skin Culture - A method to grow skin tissues that mimic normal skin.
• Reconstructs - 3D skin models created from isolated human skin cells.

• Introduce 3D Skin Models: These are laboratory-grown structures that mimic the natural layers of skin (e.g., human skin samples).
• Key Concepts: They involve processes like epidermalization, that replicate skin cell behaviour (e.g., epidermalization).
• Underlying Mechanisms: The constructs are created by embedding cells in collagen and refining them in different stages.
• Connect to Experiment: The experiment involves creating an organotypic skin culture using a multi-well plate and cell substances.

• What are 3D Skin Models and how are they established (including organotypic skin culture)?
• What does the process of epidermalization entail?
• What are the mechanisms used in creating skin reconstructs?

• Describe Practical Applications: 3D skin models are vital in dermatological research and skincare product testing (e.g., 3D skin models).
• Industry Impact: They greatly influence sectors like healthcare and cosmetology (e.g., human skin samples).
• Societal Importance: Advancements in skin models can benefit personalized medicine and reduce animal testing (e.g., reconstructs).
• Link to Scientific Advancements: They enable understanding of skin diseases and testing of potential treatments.