HCR-ДНК FISH: Метод флуоресцентной гибридизации in situ для обнаружения вирусной ДНК в инфицированных клетках

- HCR-FISH, или гибридизационная цепная реакция-флуоресцентная гибридизация in situ, обнаруживает последовательности вирусных нуклеиновых кислот в геноме инфицированных вирусом клеток. Для начала закрепите адгезную культуру инфицированных вирусом клеток и пропитайте их клеточную мембрану. Инкубируйте клетки с буфером для гибридизации, чтобы уменьшить любой фоновый сигнал. Обработайте клетки инициирующими зондами, несущими инициирующую последовательность HCR и комплементарную последовательность, нацеленную на вирусную ДНК. Нагрейте образец, чтобы денатурировать двухцепочечную ДНК хозяина до одноцепочечной ДНК. Инкубируйте образец, чтобы зонд мог связаться с его комплементарной последовательностью вирусной ДНК.

Затем обработайте амплификационным буфером, содержащим два набора флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов-шпилек, H1 и H2. Инкубируйте для облегчения цепной реакции гибридизации. Непарная инициирующая последовательность связывается со своим комплементарным хвостом H1, линеаризуя структуру шпильки. Открытая последовательность H1 аналогичным образом связывается со своим комплементарным хвостом H2. Замыкающий H2 продолжает связываться с хвостом H1. Таким образом, зонды с ф