HCR-ДНК FISH: Метод флуоресцентной гибридизации in situ для обнаружения вирусной ДНК в инфицированных клетках

- HCR-FISH, или гибридизационная цепная реакция-флуоресцентная гибридизация in situ, обнаруживает последовательности вирусных нуклеиновых кислот в геноме инфицированных вирусом клеток. Для начала закрепите адгезную культуру инфицированных вирусом клеток и пропитайте их клеточную мембрану. Инкубируйте клетки с буфером для гибридизации, чтобы уменьшить любой фоновый сигнал. Обработайте клетки инициирующими зондами, несущими инициирующую последовательность HCR и комплементарную последовательность, нацеленную на вирусную ДНК. Нагрейте образец, чтобы денатурировать двухцепочечную ДНК хозяина до одноцепочечной ДНК. Инкубируйте образец, чтобы зонд мог связаться с его комплементарной последовательностью вирусной ДНК.

Затем обработайте амплификационным буфером, содержащим два набора флуоресцентно меченых олигонуклеотидных зондов-шпилек, H1 и H2. Инкубируйте для облегчения цепной реакции гибридизации. Непарная инициирующая последовательность связывается со своим комплементарным хвостом H1, линеаризуя структуру шпильки. Открытая последовательность H1 аналогичным образом связывается со своим комплементарным хвостом H2. Замыкающий H2 продолжает связываться с хвостом H1. Таким образом, зонды с флуоресцентными метками усиливаются вокруг целевого участка, излучая сильный сигнал. Обработайте образец DAPI, чтобы окрашивать ядра клеток.

Используйте флуоресцентный микроскоп для обнаружения яркой флуоресценции в очагах репликации в ядрах инфицированных клеток. В следующем протоколе мы покажем in situ HCR-ДНК FISH для обнаружения генома полиомавируса клеток Меркеля в инфицированных первичных клетках кожи человека.

- Сначала закрепите ячейки на покровных листах с 4% PFA в PBS на 10 минут. Затем дважды промойте покровные стекла PBS и обработайте их 70% этанолом при температуре 4 градуса Цельсия на ночь, чтобы проникнуть в клетки. На следующий день замените этанол зондовым буфером для гидратации и инкубируйте при комнатной температуре в течение 60 минут для предварительной гибридизации образцов. За 30 минут до окончания инкубации перед гибридизацией разведите зонды в растворе зондовой гибридизации в соотношении 1:500 и инкубируйте при температуре 45 градусов Цельсия.

Когда инкубация будет завершена, нанесите пипеткой примерно 10 микролитров разбавленной смеси зондов на предметное стекло микроскопа для каждого покровного стекла. Поместите каждую крышку клеткой вниз на соответствующую каплю гибридизационной смеси. Используя обильное количество резинового цемента, запечатайте края и заднюю часть каждого накладочного стекла к его слайду. Установите предметные стекла на плоскую сторону нагревательного блока и нагрейте их до 94 градусов Цельсия в течение 3 минут. После этого перенесите предметные стекла во увлажненную камеру и инкубируйте их при температуре 45 градусов Цельсия в течение ночи.

На следующий день с помощью щипцов осторожно снимите резиновый цемент. Поместите защитные стекла клеточной стороной вверх в лунки 24-луночного планшета и промойте их зондовым промывочным буфером три раза при комнатной температуре. Добавьте 200 микролитров амплификационного буфера в каждую лунку, содержащую крышку, и выдерживайте при комнатной температуре от 30 до 60 минут. Тем временем отжигайте каждую из двух меченых олигонуклеотидных шпилек, узнавая зонды в отдельных ПЦР-пробирках, нагревая их до 95 градусов Цельсия в течение 90 секунд, а затем охлаждая до комнатной температуры в течение 30 минут. Смешайте шпильки в буфере для усиления в разведении 1:50.

Затем натяните парафиновую пленку на открытую поверхность крышки 12-луночной пластины, чтобы создать поверхность для реакции амплификации. Пипеткой нанесите от 50 до 100 микролитров смеси шпилек на парафиновую пленку для каждого покровного стекла. С помощью щипцов осторожно удалите каждый покровный листок из раствора для предварительного усиления и прикоснитесь к краю пористой, одноразовой салфеткой для просушки. Поместите каждую высохшую защитную пленку клеточной стороной вниз на каплю усиления. Перенесите крышку тарелки во увлажненную камеру и инкубируйте в течение ночи при комнатной температуре и в темноте.

На следующий день верните крышку стекла в лунки 24-луночной пластины. Добавьте в каждую лунку 5x SSCT-содержащий DAPI в концентрации 0,5 мкг на миллилитр и инкубируйте при комнатной температуре в течение одного часа. После этого дважды промойте образцы 5x SSCT при комнатной температуре. Закрепите промытую крышку на предметные стекла микроскопа и используйте инвертированный флуоресцентный микроскоп для анализа клеток и получения изображений образцов.