Рекомбинантный препарат вириона на основе полиомавируса клеток Меркеля (MCPyV): способ получения рекомбинантного вириона MCPyV с высоким титром

- Полиомавирус клеток Меркеля, или MCPyV, представляет собой онковирус с двухцепочечной ДНК с кольцевым геномом, который вызывает карциному клеток Меркеля, тип рака кожи. Чтобы получить вирионы MCPyV, сначала обрабатывают адгезивную культуру упаковочных клеток коктейлем, содержащим агент для трансфекции, вирусный геном и две экспрессирующие плазмиды, кодирующие белки, необходимые для стимулирования репликации вируса.

Во время инкубации трансфекционный реагент образует липоплексы с плазмидами, облегчая их доставку в клетки-упаковки. Оказавшись внутри ядра, клеточный механизм обеспечивает экспрессию вирусных и плазмидных геномов. Экспрессирующие плазмиды кодируют белки антигена большой опухоли и антигена мелкой опухоли. Эти белки транслоцируются в ядро и стимулируют репликацию вирусной ДНК. Впоследствии вирусный геном кодирует структурные белки капсида. Эти белки перемещаются в ядро и помогают в сборке рекомбинантных вирионов.

Далее соберите культивируемые клетки. Обработайте их раствором, содержащим моющее средство и ДНКазу. Детергент лизирует клетки, чтобы высвободить вирусы. ДНКаза разрушает любую свободную плазмидную ДНК из суспензии. Центрифуга для отделения клеточного мусора в грануле. Загрузите вируссодержащую надосадочную жидкость в пробирку, содержащую подходящую среду с градиентом плотности. Центрифуга для получения концентрированных фракций, богатых вирионами, в градиентной среде.

В следующем протоколе мы покажем получение рекомбинантных вирионов MCPyV с высоким титром с использованием клеток 293TT.

- Ближе к вечеру или вечером посейте 6 миллионов клеток 293TT-28 в 10-сантиметровую чашку, содержащую добавленную среду DMEM. Инкубировать при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. На следующее утро убедитесь, что клетки сливаются примерно на 50%. Затем трансфектируют клетки 66 микролитрами реагента для трансфекции, 12 микрограммами религированной ДНК изолята MCPyV R17b, 8,4 микрограммами плазмиды экспрессии ST pMtB и 9,6 микрограммами плазмиды экспрессии LT pADL. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом.

На следующий день, когда трансфицированные клетки почти сливаются, трипсинизируйте клетки и перенесите их в 15-сантиметровую чашку для продолжения экспансии. Когда эта чашка станет почти сливающейся, перенесите клетки в три новые 15-сантиметровые чашки. Когда эти новые чашки станут почти сливающимися, соберите клетки, как указано в текстовом протоколе. Центрифуга при 180 х г при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем удалите надосадочную жидкость и добавьте 1 клеточный объем DPBS-Mg.

Добавьте 25 микромолярного сульфата аммония, затем 0,5% Triton X-100, 0,1% бензоназы и 0,1% АТФ-зависимой ДНКазы. Хорошо перемешайте и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. На следующий день остудите смесь на льду в течение 15 минут. Далее добавьте 0,17 объема хлорида натрия. Перемешайте и выдержите на льду еще 15 минут. Центрифугируйте при 12000 х г при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Если надосадочная жидкость непрозрачная, аккуратно переверните пробирку и повторите центрифугирование.

После этого переложите надосадочную жидкость в новую трубку. Ресуспендировать гранулу в одном объеме ДАБС с добавлением 0,8 молей хлорида натрия. Центрифугируйте при 12000 х г при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут. Если надосадочная жидкость непрозрачная, аккуратно переверните пробирку и повторите центрифугирование. Соедините две надосадочные жидкости и снова центрифугируйте при температуре 12000 x g при 4 градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем с помощью пипетки нанесите градиенты йодиксонала в тонкостенные полиалломеровые пробирки объемом 5 миллилитров, как указано в текстовом протоколе. Сверху на приготовленный йодиксональный градиент загрузите 3 миллилитра осветленной, вируссодержащей надосадочной жидкости. Центрифугируйте с ротором SW55ti при температуре 234 000 x g и 16 градусах Цельсия в течение 3,5 часов, стараясь замедлить ускорение и замедление. После завершения ультрацентрифугирования соберите 12 фракций в силиконизированные пробирки.