Анализ образования колоний кератиноцитов: анализ in vitro для оценки способности кератиноцитов расти в колонии

- Анализ на образование колоний определяет способность отдельных клеток к пролиферации и образованию колоний. Начните с иссечения спинной кожи мыши в культуральной тарелке. Соскребите подкожную клетчатку и жир с вентральной стороны кожи. Обработайте ткани раствором для пищеварения. Протеолитические ферменты в растворе разрушают внеклеточный матрикс, вызывая диссоциацию эпидермальных клеток.

Аккуратно соскребите эпидермальный слой, чтобы высвободить диссоциирующие клетки и волоски в среду для сбора. Отфильтруйте суспензию через соответствующее ситечко, чтобы улавливать волоски или любой мусор и получить одноклеточную суспензию эпидермальных клеток. Перенесите желаемый объем этой клеточной суспензии в покрытую коллагеном пластину, содержащую адгезивный слой питающих клеток, остановленных ростом. Дополните подходящей средой, способствующей выживанию кератиноцитов.

Во время культивирования кератиноциты прикрепляются к питающему слою. Кроме того, эти фидерные клетки секретируют факторы роста и синтезируют белки внеклеточного матрикса, которые поддерживают рост кератиноцитов. В зависимости от пролиферативной способности отдельных кератиноцитов, они начинают образовывать колонии. Удалите носители и закрепите колонии. Окрасьте клетки подходящим красителем, чтобы обнаружить колонии для подсчета. В следующем протоколе мы проведем клоногенный анализ первичных кератиноцитов, полученных от взрослых мышей после обработки тестируемыми соединениями.

- После сбора образцов кожи спинной части тела усыпленных взрослых мышей с помощью автоклавных щипцов и скальпеля поместите по одной спинной коже волосистой стороной вниз в тонкую чашку Петри и соскребите подкожную клетчатку, включая жир, с вентральной стороны кожной ткани, пока ткань не станет полупрозрачной.

Поместите эту очищенную кожу в PBS до тех пор, пока не будут обработаны все остальные шкуры. Затем с помощью скальпеля разрежьте образцы кожи на полоски размером от 0,5 x 1 до 1,5 сантиметра. Поместите полоски волосистой стороной вверх в стерильную чашку Петри, прежде чем поместить образцы волосатой стороной вверх на поверхность 20-миллилитрового раствора PBS плюс 2x Gentamicin, дополненного 0,25% трипсина, в пластиковой чашке Петри размером 100 x 20 миллиметров на 2 часа при температуре 32 градуса Цельсия.

В конце инкубации поместите стерильную пластиковую квадратную чашку Петри, содержащую 15 миллилитров рабочей среды, под углом 30 градусов и с помощью изогнутых щипцов осторожно перенесите в чашку плавающую полоску кожи. Держа новое лезвие скальпеля под перпендикулярным углом к коже и применяя достаточную, но не чрезмерную силу, соскребите эпидермис и волоски с образца в среду.

Когда все полоски будут соскоблены, осторожно сцедите надосадочную жидкость, содержащую эпидермальные клетки, в стерильную 60-миллилитровую банку, содержащую 1,5-дюймовую магнитную мешалку, и промойте чашку Петри дополнительной средой для сбора любых оставшихся эпидермальных клеток.

Доведите итоговый объем в банке до 30 миллилитров со свежей средой, и размешайте раствор клеток эпидермиса со скоростью 100 оборотов в минуту в течение 20 минут при комнатной температуре. По окончании инкубации с перемешиванием в шкафу биобезопасности снимите мешалку и отфильтруйте клеточный раствор через 70-микрометровое сетчатое фильтр в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Используйте щипцы, а затем пипетку, чтобы продавить волоски и материалы рогового слоя через ситечко, чтобы манипулировать тканью, чтобы освободить захваченные волосковые клетки, и используйте дополнительные 5 миллилитров собирающей среды, чтобы выпустить оставшиеся захваченные волосковые клетки в трубку.

- Крайне важно, чтобы клетки эпидермиса и волосы были обработаны таким образом, чтобы высвободить клетки из волосяных фолликулов.

- Доведите общий объем в пробирке до 50 миллилитров со свежей средой и соберите клеточный фильтрат центрифугированием. Суспендируйте гранулу в 5 миллилитрах свежей заготовительной среды и около 20 растираний с помощью 5-миллилитровой пипетки. Возьмите 0,5 миллилитра из разведения 1:20 и переложите его в 2-миллилитровую микрофуговую пробирку.

После тщательного перемешивания образца возьмите 200 микролитров из микрофуг-пробирки и аккуратно перемешайте с равным объемом 0,4% раствора Трипана Синего. Аккуратно перемешайте этот раствор три раза и перенесите клетки в гемацитометр для подсчета кератиноцитов с ядрами.

Оцените все темно-синие клетки как нежизнеспособные, а маленькие золотисто-розоватые клетки — как жизнеспособные. Жизнеспособность в среднем составляет около 80%, а конечный выход кератиноцитов на одну мышь должен составить около 30 миллионов жизнеспособных клеток. После подсчета соберите клетки еще одним центрифугированием, а для массового культивирования ресуспендируйте от 2 до 4 раз по 10 до шестой жизнеспособной кератиноцитов на 35 миллиметровую чашку Петри в 2 миллилитрах клеточной питательной среды.

Для анализа на клоногенное колониеобразование ресуспендируйте клетки в соотношении 1 умно-10 на треть кератиноцита на 4 миллилитра модифицированной среды William's E с добавками и концентрацией сыворотки на покрытую коллагеном 60-миллиметровую чашку Петри на облученных рентгеновскими лучами слоях питателя швейцарской мыши 3T3.

Для массовой культуры выращивают культуры при температуре 32 градуса Цельсия в 5% углекислом газе в течение соответствующего периода культивирования клеток, меняя среду через 24 часа после первоначального посева для массовой культуры и 3 раза в неделю после этого.

В конце клональной культуры аспирируйте среду и зафиксируйте колонии в 10% буферизованном формалине на ночь при комнатной температуре. На следующее утро окрасьте колонии 0,5% родамина B в автоклавной воде в течение одного часа, а затем ополосните посуду в холодной автоклавной воде, пока вода не станет прозрачной. Затем наклоните посуду на крышках, чтобы она высохла, прежде чем подсчитывать колонии.