miniCoopR Векторный трансгенез: метод скрининга генов, индуцирующих меланому, в модели опухоли данио-рерио

- У рыбок данио меланома возникает в результате злокачественной трансформации меланоцитов – клеток, продуцирующих меланин. Для изучения начала меланомы используйте модель склонных к меланоме трансгенных рыбок данио-рерио с дефицитом меланоцитов. В этой модели отсутствуют меланоциты из-за потери функции мутации в ее меланоцит-специфичном промоторе mitfa.

Начните с того, что возьмите одноклеточный эмбрион этой трансгенной модели на агаровой пластине. Одновременно введите в эмбрион смесь, содержащую вектор miniCoopR на основе транспозона и мРНК фермента транспозазы. Вектор содержит генную кассету, содержащую миниген mitfa, несущий промотор, связанный с геном-кандидатом, зажатым между двумя элементами транспозона.

Коинъецируемые мРНК кодируют белки транспозазы. Эти белки воздействуют на элементы транспозона и катализируют кассетное эксцизию из вектора miniCoopR с последующей его интеграцией в геномную ДНК эмбриона. Впоследствии промотор кассеты управляет экспрессией как гена mitfa, так и гена-кандидата, представляющего интерес.

Ген mitfa поддерживает спасение и развитие меланоцитов, в то время как ген-кандидат, если он онкогенный, вызывает начало меланомы. Просмотрите развитую рыбку данио. У трансгенных рыб со спасенными меланоцитами развивается пигментация меланина, в то время как у тех, кто несет меланому, возникают повышенные пигментные поражения.

В следующем протоколе мы покажем скрининг модификаторов начала меланомы с использованием векторов miniCoopR в моделях трансгенных опухолей рыбок данио.

- Чтобы создать конструкции для инъекции, начните с создания клонов среднего входа Gateway с помощью ПЦР, амплифицирующей полноразмерную открытую рамку считывания интересующих генов и рекомбинирующей в pDONR221. Затем используйте технологию Multisite Gateway для рекомбинации меланоцит-специфичного промотора mitfa, интересующего гена и сигнала полиаденилирования в вектор miniCoopR, чтобы поместить интересующие гены под контроль промотора mitfa.

Введите 25 пикограмм каждого клона вместе с 25 пикограммами мРНК транспоназы Tol2 в одноклеточные, трансгенные, тройной гомозиготные эмбрионы рыбок данио. Мутантные животные mitfa-BRAF-p53 имеют дефицит меланоцитов и склонны к трансформации и образованию меланомы. Наряду с интересующим геном, вектор miniCoopR содержит спасительный миниген mitfa. Так, у успешно введенных животных разовьются спасенные меланоциты, которые экспрессируют интересующий их ген.

Инкубируйте введенные эмбрионы при температуре 28,5 градусов Цельсия. Через 24 часа после оплодотворения удалите все мертвые эмбрионы. Через 72 часа после оплодотворения с помощью препарирующего микроскопа под падающим светом на белом фоне отбирают трансгенных животных с спасенными меланоцитами.

Когда животные достигнут 4 дня после оплодотворения, пересадите их в 3-литровые резервуары в питомнике питомника для рыбок данио. В возрасте 2 месяцев выберите животных, у которых хотя бы одна область спасения меланоцитов превышает 4 миллиметра в квадрате. Еженедельно проводите скрининг выбранных животных на наличие опухолей. Изолируйте опухоленосных животных для исследования.

Нарисуйте кривые выживаемости без меланомы с возрастом и неделями на абсциссе и процентом выживаемости без меланомы на ординате. Сравните животных с меланоцитами, экспрессирующими ген, представляющий интерес для контрольных животных, экспрессирующих EGFP в меланоцитах. Используйте логарифмический ранговый тест, чтобы определить, являются ли эти две кривые статистически различными.