JoVE Encyclopedia of Experiments
Исследования рака
0 просмотров • 3:45 мин • April 30th, 2023
- Факторы транскрипции — это белки, содержащие ДНК-связывающие домены. Они связываются с определенными последовательностями ДНК и помогают регулировать экспрессию генов в клетках. Чтобы определить экспрессию транскрипционного фактора в меланоцитах, связанных с чешуей, сначала собирают темные пигментированные дорсальные чешуйки у рыбок данио, находящихся под наркозом. Зафиксируйте чешуйки и обработайте их раствором для пермеабилизации, чтобы сделать отдельные меланоциты проницаемыми.
Обработайте раствором отбеливателя, чтобы удалить из клеток темные гранулы пигмента меланина. Этот процесс отбеливания исключает вероятность появления пигментных фоновых сигналов на последующих этапах окрашивания. Инкубируйте с блокирующим раствором, содержащим белки, чтобы блокировать неспецифические участки связывания белков на поверхности клетки.
Теперь обработайте образец желаемыми первичными антителами. Эти антитела связываются со своими мишенями транскрипционными факторами внутри клеток. Затем пометьте образец вторичными антителами, помеченными флуоресцентными метками, специфичными к первичным антителам. Кроме того, обработайте образец подходящим флуоресцентным ДНК-связывающим красителем, чтобы окрашивать ядра клеток. Используйте флуоресцентный микроскоп для обнаружения ярких флуоресцентных излучений комплексов фактор-антитело и ядра клеток.
В следующем протоколе мы покажем иммуноокрашивание меланоцитов, ассоциированных с дорсальными чешуйками, экспрессирующих меланоцит-индуцирующий фактор транскрипции-А, или mitfa, у трансгенных рыбок данио
.- Для выполнения иммуноокрашивания обезболите рыб в дозе 0,17 миллиграмм на миллилитр трикаина. Под падающим светом под препарирующим микроскопом используйте острые щипцы с тонкими наконечниками для выщипывания тыльной чешуи, стараясь не повредить половину чешуи, содержащую меланоциты. Поместите чешуйки непосредственно из щипцов в 1 миллилитр фиксатора и инкубируйте при комнатной температуре, переворачивая, более или равным 2 часам. Пересадите рыбу в рыбную воду и следите за ней, чтобы подтвердить успешное выздоровление.
Чтобы отбелить пигментированные меланоциты, сначала промойте неподвижные чешуйки в PBST два раза в течение 5 минут при комнатной температуре. Далее добавьте 1 миллилитр свежеприготовленного раствора отбеливателя и накройте парапленкой или колпачковыми замками, чтобы газ не лопнул трубки. Продолжайте отбеливание, пока пигмент не исчезнет. Затем постирайте в PBST четыре раза в течение 5 минут при комнатной температуре.
Инкубировать не менее 30 минут в блочном растворе. Затем инкубируйте с примерно 400 микролитрами первичного антитела в блочном растворе в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день промойте чешуйки три раза в течение 30 минут в PBST при комнатной температуре. Инкубировать с вторичными антителами в течение 2 часов до ночи при комнатной температуре.
После окрашивания DAPI нанесите каплю vectashield на предметное стекло и установите весы так, чтобы вогнутая сторона весов была обращена вниз к предметному стеколу. Накройте образцы стеклянной крышкой. Используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы запечатать края, и наблюдайте за предметными стеклами под флуоресцентным микроскопом.