Анализ подкожной трансплантации: метод трансплантации клеток меланомы от донора к модели реципиентной рыбки данио-рерио

- Во время анализа на трансплантацию меланомы раковые клетки из рыбок данио-рерио, несущих опухоль, трансплантируются в модель реципиента с ослабленным иммунитетом для изучения развития опухоли. Начните с того, что возьмите усыпленную донорскую рыбку данио-рерио, несущую опухоль, и хирургическим путем удалите опухоль из ее тела. Перенесите опухоль в чашку Петри, содержащую подходящий буфер, и измельчите ее на мелкие кусочки.

Далее растирают фрагменты опухоли с помощью пипетки. При этом фрагменты опухоли диссоциируются на отдельные клетки. Теперь загрузите суспензию опухолевых клеток в шприц. Затем подготовьте реципиента с ослабленным иммунитетом рыбку данио Каспер на фильтровальной бумаге. Этот мутантный вариант данио-рерио с дефицитом пигментации не имеет меланоцитов и иридофоров, что делает его прозрачным и универсальным для экспериментов по визуализации и трансплантации.

Затем введите предварительно загруженную суспензию клеток меланомы подкожно в область над брюшной полостью, на полпути между задним мозгом и спинным плавником рыбки данио Каспера. Теперь перенесите рыбу-реципиента в воду и наблюдайте за ней, чтобы наблюдать за развитием опухоли. Прозрачное тело рыбок данио помогает в легкой визуализации развившихся опухолей.

В следующем протоколе мы покажем трансплантацию клеток меланомы от трансгенного донора данио-рерио, несущего опухоль, на модель рыбы Каспера с ослабленным иммунитетом.

- После облучения реципиентных 2-3-месячных рыб Каспер гамма-излучением 25 Гр за один день до трансплантации, дайте им восстановиться в рыбной воде. Используйте трикаин для усыпления рыбы-носителя опухоли. Отрежьте опухоль и поместите ее в чашку Петри с примерно 5 миллилитрами фильтра, стерилизованного 0,9x PBS с 5% FPS. С помощью бритвы нарежьте опухоль кубиками, пока она находится в растворе.

Работая при комнатной температуре и с помощью пипетки P1000, растирайте для получения одиночных клеток. Доведите объем до 25 миллилитров. Отфильтруйте раствор через сетчатый фильтр 40 микрометров и вращайте в настольной центрифуге при давлении 453 rcf в течение 10 минут. Ресуспендируйте гранулу в 0,9% PBS 5% FBS до нужной концентрации.

С помощью гемоцитометра рассчитать точное количество клеток и развести клеточную суспензию так, чтобы итоговый объем инъекции составил примерно 5 микролитров. Например, если необходимо ввести 50 000 клеток, клеточную суспензию следует разбавить до конечной концентрации 10 000 клеток на микролитр. Каждые несколько минут переворачивайте пробирку, содержащую клеточную суспензию, чтобы предотвратить слипание клеток.

Со 100% этанолом и 0,9x PBS промойте калибр 26s (кончик со скосом) 701 N 10 микролитров Hamilton 2-3 раза перед загрузкой шприца 5 микролитрами клеточной суспензии. Обезболив облученную рыбу-реципиента трикаином, положите ее на бок на влажную кисельную салфетку.

Стабилизируйте рыбу одной рукой и введите иглу скосом вверх под углом 45 градусов в бок рыбы над брюшной полостью примерно на полпути между задней границей заднего мозга и внутренней границей спинного плавника. Осторожно нажмите на поршень. Дайте рыбам восстановиться в пресной рыбной воде и ежедневно наблюдайте за рыбами на предмет приживления опухоли. Если приживление произошло, также может наблюдаться дальнейший рост и развитие болезни.