Запись Многоклеточные Поведение в Myxococcus Ксанф Биопленки использованием Покадровый микрокиносъемки

Общая цель данного эксперимента заключается в разработке дешевого покадрового микрокинематографического анализа с достаточной точностью для получения воспроизводимых и поддающихся количественной оценке результатов. Это достигается за счет использования недорогих многоразовых силиконовых прокладок для изготовления пластин агрос или предметных стекол для микроскопа. Получены результаты, которые показывают, что эти комплексы пластин остаются гидратированными и достаточно насыщенными кислородом в течение более недели при различных типах сред и концентраций агара.

Кроме того, поскольку покадровая микрокинематография является медленным процессом, использование восьми недорогих микроскопов помогает ускорить сбор данных. Здравствуйте, я Райан Тейлор из лаборатории доктора Роя Уэлча с факультета биологии Сиракузского университета. Сегодня мы покажем вам процедуру создания покадровых фильмов бактериальных биопленок в нашей лаборатории, с помощью которой мы изучим многоклеточное поведение биопленок MTI.

Итак, приступим. Чтобы начать эту процедуру, измерьте плотность клеток в ночной смеси культуры Occus sanus с помощью измерителя, переведите один миллилитр культуры в центрифужную пробирку объемом 2,5 миллилитра, промойте гранулы и ресуспендируйте бактерии в среде TPM, как описано в прилагаемом письменном протоколе, пипетке и вихре для полной ресуспендирования гранулы, что может занять некоторое время. Далее добавьте 0,5 грамма ароса в 50 миллилитров TPM, который является пробирной средой.

Также добавьте 0,5 грамма AROS в 50 миллилитров C-T-T-Y-E, который является питательным диском для автоклава для стерилизации. Затем поддерживают среду при температуре 55 градусов Цельсия в инкубаторе или на водяной бане. При построении трекингового анализа.

Пластинчатые комплексы приступают к построению питательного диска первого пламенного стерилизатора стеклянного микроскопа. Сдвиньте и поместите стерильную прокладку из силиконовой резины толщиной 0,5 миллиметра поверх предметного стекла. Пипетки впрыскивают около 300 микролитров фильтрующего материала C TT Ye в лунку, созданную прокладкой на предметном стекле

C-T-T-Y-E media agro должен разжечь пламя, простерилизовать еще одну горку и поставить ее под углом на вершину C-T-T-Y-E media aros. Установка затвора вниз под углом предотвращает образование пузырей. Как только предметное стекло будет на месте, надавите на комплекс с помощью мини-зажимов для крепления, по одному с каждой стороны.

Поместите обрезанный комплекс при температуре четыре градуса Цельсия и дайте медиа агро C-T-T-Y-E застыть. Обычно это занимает около пяти минут. После того, как агро схватывается, можно готовить пластинчатые комплексы, используемые в пробирном анализе.

Начните с подготовки слайдов для построения пробирных комплексов. Для каждого комплекса пламенно стерилизуется два стекла микроскопа на предметных стеклах. Поместите прокладку автоклава поверх одного из предметных стекол, чтобы сформировать дно анализа.

Другая горка используется для выравнивания агроса и в качестве опорной горки. Верхняя часть пробы представляет собой покровный лист. Сначала оберните предметное стекло микроскопа маркировочной лентой, затем пламя стерилизатора стеклянной крышкой слипа и поместите его сверху на обернутое стекло стерилизованным скотчем.

Сдвиньте вверх обернутую застежку, поддерживая крышку, предотвращая ее растрескивание. Поместите прокладку автоклава поверх стерилизованной пламенем крышки с щипцами. Нажмите на прокладки на нижней заслонке и защитное стекло, чтобы убедиться, что они образуют уплотнение со стеклом.

В противном случае носители и массивы могут пересохнуть. Отложите скользящую прокладку и защитную прокладку в сторону стерилизованными сторонами вверх и теперь работайте только над одним комплексом за раз, чтобы предотвратить затвердевание фильтрующего материала, которое может привести к ухудшению качества фильма. Начните с установки питательного диска.

Уберите питательный диск комплекс с четырех градусов Цельсия. Снимите связующее затмение и предыдущую часть предметных стекол, обнажая теперь застывшие C-T-T-Y-E аросы с помощью пипетки для микроотбора проб с одноразовым наконечником из стеклянного стакана объемом 100 микролитров. Извлеките питательный диск диаметром один миллиметр из C-T-T-Y-E media agro и поместите его в лунку, образованную прокладкой на защитном листе.

Затем извлеките фильтрующий материал TPM agros из инкубатора и нанесите пипеткой 300 микролитров в лунку, созданную прокладкой на крышке и содержащую питательный диск. Фильтрующий материал TPM Agros должен иметь насыпь до выравнивания среды T-P-M-S-A Поместите одну из стерилизованных пламенем стекол без прокладки под углом поверх среды TPM aros. Размещение предметного стекла под углом помогает предотвратить образование пузырьков.

Зажмите комплекс между собой мини-связующими зажимами по одному с каждой стороны. Поместите обрезанный комплекс при температуре четыре градуса Цельсия и дайте возникшему носителю схватиться. Обычно это занимает около пяти минут.

Как только возникшая среда схватится, снимите комплекс с четырех градусов Цельсия. Снимите связующие зажимы и сожмите торец комплекса. Чтобы ослабить обмотанную лентой горку, снимите обмотанную лентой горку и положите ее на скамейку для дальнейшего использования.

Затем с помощью щипцов в качестве клина. Отделите защитную скользящую прокладку фильтрующего материала агрос комплекса от опорной горки и выбросьте опорную горку. Не используйте поддевательное движение для отделения комплекса прокладок защитного скольжения, так как это может привести к торможению проскальзывания крышки и/или прилипанию фильтрующего материала к опорному заслонке.

После снятия опорного ползуна поместите защитную прокладку прокладки фильтрующего материала комплекса на обернутую лентой ползунок прокладкой вверх. Поместите этот комплекс рядом с горелкой, чтобы вся видимая влага испарилась с поверхности только что обнаженного материала. Не допускайте высыхания фильтрующего материала дольше одной минуты.

Поскольку это может повлиять на роевое поведение M Zant, приступайте к нанесению на клетки только что приготовленного комплекса анализа. После того, как лишняя влага испарится с покровной скользящей прокладкой, агрос комплекс аспирирует 0,5 микролитра концентрированных ячеек для осаждения на фильтрующий материал. Аэро нажимают на кончик пипетки перед приближением к фильтрующему материалу.

Капля клеток появляется в нижней части наконечника пипетки, что облегчает нанесение клеток без соприкосновения кончика с фильтрующим материалом. Углубление на поверхности агроса может изменить поведение роя. Переместите пипетку прямо вниз, чтобы распределить клетки на расстоянии примерно одного миллиметра от встроенного питательного диска.

Затем потяните пипетку обратно вверх. Таким образом, можно гарантировать, что рой будет круглым. После того, как ячейки будут нанесены, поместите комплекс рядом с горелкой, чтобы пятно клеток высохло не более 20 секунд.

После высыхания совместите узел скользящей прокладки, образующий дно комплекса, с прокладкой на крышке. Скользящая прокладка среды акроклеточного комплекса образует верхнюю часть комплекса. Аккуратно прижмите друг к другу, чтобы образовалось уплотнение.

Очистите поверхности затвора в защитном стекло салфеткой kim для удаления остатков и предотвращения образования конденсата. Сразу после очистки предметного стекла поместите комплекс на нагретый предметный столик с опускающимся предметным стеклом и поднятой крышкой. Если образовался конденсат, дайте слайд-комплексу постоять на нагретом столике в течение нескольких секунд перед запуском программного обеспечения для получения изображений.

Для того, чтобы подготовить фильм, выберите подходящий объектив, два х четыре х или 10 х на микроскопе. Включите камеру и микроскоп и проверьте уровень освещенности, чтобы убедиться, что свет не слишком интенсивный. Запустите компьютер и откройте программу получения изображений.

Нажмите на окно изображения в реальном времени и сфокусируйте микроскоп. Изображение выглядит примерно так, как показано здесь. Начните получать изображения.

Обязательно регулярно проверяйте фокус в течение первого часа, так как агар имеет тенденцию оседать, что приводит к смещению фокуса. После завершения получения изображений перенесите полученные изображения на хранение. Разбейте ползунковый комплекс, замочив его в 90% этаноле на ночь, или TOLA прокладки для повторного использования.

В этом видеоролике замедленной съемки показано, как они подвергаются описанному здесь анализу слежения. Скорость захвата составляет одно изображение в минуту при увеличении 20 крат, скорость воспроизведения составляет 60 изображений в секунду. В этом видеоролике показана популяция клеток, в которых 1% клеток экспрессируют GFP.

Фильм был скомпилирован путем объединения чередующихся фазовых контрастов и флуоресцентных изображений. Анализ проводили на C-T-T-Y-E в 1%Скорость захвата Aros составляет одно изображение в минуту при увеличении 100x. Этот покадровый фильм показывает скользящую моторику M Anthes.

Данный анализ проводили на C-T-T-Y-E в 1%Скорость захвата Aros составляет одно изображение в минуту при увеличении 100 раз. Этот видеоролик TimeLapse показывает подергивающуюся моторику P OSA. Данный анализ проводили на LB в 1%Скорость захвата aros составляет одно изображение в минуту.

При увеличении в 20 раз скорость воспроизведения составляет 60 изображений в секунду. В этом видеоролике показано, как Смар чувствует роевую моторику. Этот анализ проводили на LB и 1%-ной скорости захвата Aris составляет одно изображение в минуту.

При увеличении в 20 раз скорость воспроизведения составляет 60 изображений в секунду. Этот видеоролик показывает моторику скольжения EGT. Этот анализ был проведен на LB в 0,5%Скорость захвата метки составляет одно изображение в минуту, так как увеличение в 20 раз превышает скорость воспроизведения составляет 120 изображений в секунду из-за хрупкости 0,5%, возникшей в lv.

В этом анализе используются более крупные прокладки, показанные на рисунке 1 B. Мы только что показали вам, как создавать покадровые фильмы бактериальных биопленок. При этом делать эту процедуру. Важно помнить, что нужно не торопиться и быть как можно более точным для достижения стабильных результатов.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.