Хроматин Иммунопреципитация (чип) с Пробирной Динамический гистонов Внесение изменений в Активированный экспрессии генов в клетках человека

Эксперимент с чипом используется для мониторинга динамических изменений гисто-модификаций, происходящих во время STAT one, изменения экспрессии активированных генов в заполнении транскрипционных факторов, гистон-модифицирующих комплексов и сам механизм транскрипции также могут быть проанализированы таким образом. Для начала анализа клетки индуцируют интерфероном гамма для активации одного сигнала STAT, сшивают клетки формальдегидом и собирают их, затем приступают к выделению ядра и созвука, который разрезает хроматин примерно на 200-1000 фрагментов пар оснований. Затем добавьте антитело, которое нацелено на интересующую белку или гисто-модификацию, а затем осадите иммунокомплексы.

Иммунокомплексы промываются, поперечные сшивки переворачиваются, а ДНК очищается. Изменения в гисто-модификациях или наборе белков в определенные области гена могут быть определены на основе количественного ПЦР-анализа иммуноципитированной ДНК в реальном времени. Здравствуйте, меня зовут Лорен Бороу из лаборатории доктора Мелиссы Хендриксон и факультета биологии Университета Вирджинии.

Сегодня мы покажем вам процедуру иммунопреципитации хроматина. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения динамических изменений гистограмм, которые происходят во время транскрипции после передачи сигналов STAT one. Итак, приступим.

За день до начала этой процедуры культивируйте клетку так, чтобы было доступно достаточное количество для двух используемых здесь клеток FTGH. Приготовьте одну 15-сантиметровую чашку для культуры тканей с плавностью 80% для каждого анализа чипов. В каждый эксперимент включается отрицательный контроль IgG, положительный контроль пангистонных антител и дубликаты.

Чтобы начать эту процедуру, удалите питательные среды. Замените его на 20 миллилитров DMEM с добавлением 10% космической телячьей сыворотки и содержащей интерферон гамма в дозе пять нанограммов на миллилитр. Кроме того, замените среду на индуцированных пластинах 20 миллилитрами 10% C-C-S-D-M-E-M.

Далее работа в вытяжном шкафу. Наклоните 15-сантиметровую чашку для культуры тканей и добавьте 540 микролитров 37%-ного раствора формальдегида на 20 миллилитров среды. Затем покачайте тарелку, чтобы равномерно распределить ее.

Дайте сшивке восприниматься 10 минут при комнатной температуре. Затем добавьте глицин до 125 миллимолярной конечной концентрации, чтобы остановить реакцию сшивания. Вакуумируйте аспирацию среды и промойте клетки 10 миллилитров ледяного PBS с помощью скребка для клеток, соберите клетки примерно в семь миллилитров PBS и объедините клетки, которые были обработаны идентично из шести 15-сантиметровых пластин, в 50-миллилитровую коническую трубку со льдом.

Наконец, центрифугируйте собранные клетки со скоростью 1800 об/мин в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и аспирируйте PBS. Если вы остановились на этом, защелкните, заморозьте палитру ячеек и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия после сшивки. Следующим этапом является подготовка хроматина.

Начните с добавления одного миллимолярного DTT и полных ингибиторов протеазы в буфер для набухания, охлажденный на льду. Резус суспензируют из шести пластин, втягивают четыре миллилитра набухающего буфера и перекладывают в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Использование большего или меньшего буфера может изменить эффективность танца.

Инкубируйте клеточную суспензию на льду в течение 10 минут. Когда инкубация на льду будет завершена, переложите суспензию в предварительно охлажденный пух объемом 15 миллилитров и танцуйте. 20 ударов с ПЭ А после танца переносят клетки обратно в 15-миллилитровую коническую пробирку на ледяной центрифуге при 2500 оборотах в минуту в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбрасывают надосадочную жидкость, покидая ядерную гранулу.

Добавляйте полные ингибиторы протеазы в охлажденный на льду буфер ультразвука. Из шести пластин получается около 200 микролитров ядерной таблетки Resus. Суспендируйте гранулу в 15 объемах гранул или трех миллилитрах буфера для ультразвука.

Использование разного объема для такого количества клеток может изменить эффективность ультразвука. Эффективность ультразвуковой обработки должна быть заранее определена для вашего лабораторного атора. Здесь используется ультразвуковой аппарат Miss Sonic 3000, оснащенный микрочипом.

Ультразвуком обрабатывайте ядра суспензии на льду в течение 10 циклов в течение 20 секунд на и 40 секунд с выключением при амплитуде 8. Обычно это приводит к тому, что фрагменты хроматина имеют средний размер от 200 до 1000 пар оснований после завершения ультразвуковой обработки. Перенесите обработанный ультразвуком материал в центрифужную трубку SS 34 и центрифугуйте при 13 000 об/мин в течение 20 минут при температуре четыре градуса Цельсия.

В роторе SS 34 до мусора гранулятора, который обычно составляет небольшое количество. Осторожно переложите супинат в коническую трубку объемом 15 миллилитров на льду. Перейдите к чипу, чтобы уменьшить фон от неспецифических событий привязки.

Сначала предварительно очистите препарат хроматина, добавив 360 микролитров белка ДНК спермы лосося А или G в суспензию агрогранул и покачивайте при температуре четыре градуса Цельсия не менее 30 минут. Центрифугируйте при 1000 об/мин в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, чтобы гранулировать агробусины. Затем переложите предварительно очищенный лежачий натин в другую кональную трубку объемом 15 миллилитров на лед.

Затем измерьте поглощение 260 нанометров или 260 единиц хроматина. Разведите 10 микролитров преклюдного хроматина в 190 микролитрах дважды дистиллированной воды. Для заготовки соедините 10 микролитров буфера для ультразвуковой обработки со 190 микролитрами дважды дистиллированной воды.

Отрегулируйте громкость сэмпла с помощью буфера ультразвука до четырех А 260 единиц. Сохраните 75 микролитров предварительно очищенного хроматина в четырех и двух 60 единицах в качестве входного образца и храните при температуре минус 20 градусов Цельсия до готовности к обратным поперечным связям. Помните, что этот шаг имеет решающее значение для анализа данных.

Так что не пренебрегайте взятием входной аликвоты, раздайте оставшийся препарат хроматина в одном миллилитре аликвот в микропробирки по 1,7 миллилитра со льдом. Если вы остановитесь здесь, сделайте щелчок. Подготовленный хроматин заморозьте на сухом льду и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

Однако, поскольку накопленный хроматин может деградировать, лучше всего продолжать использовать ip. Теперь добавьте антитела чипового качества к индуцированным и неиндуцированным наборам образцов. В двух экземплярах.

Как правило, один-два микрограмма антитела работают хорошо, но количество должно быть определено заранее опытным путем. Добавьте два микрограмма IgG и 15 микролитров пангистона H трех антител в качестве отрицательного и положительного контроля к индуцированным и неиндуцированным наборам образцов. Кроме того, прокачайте все пробирки на ночь при температуре четыре градуса Цельсия, прежде чем приступить к выделению иммунокомплексов после ночной инкубации с антителами.

Добавьте во все пробирки 60 микролитров спермы лосося, ДНК, белка А или протеина жиробулочной суспензии. Ракета нагревается на четыре градуса Цельсия не менее 60 минут. Для связывания иммунокомплексов с бусинами.

Гранулируйте иммунокомплексы, связанные с агросом, микроосторожно при 2000 об/мин в течение трех минут при четырех градусах Цельсия, аспирируйте надосадочную жидкость. Затем выполните серию промывок буфером, начиная с промывки с низким содержанием соли, за которой следует промывка с высоким содержанием соли. Затем хлорид лития промыть.

И, наконец, две промывки TE в каждый из буферов промывки. Добавьте PMSF непосредственно перед использованием, промойте одним миллилитром буфера в течение 10 минут с покачиванием при четырех градусах Цельсия, микров в течение трех минут при 2000 об/мин при четырех градусах Цельсия и аспирируйте надосадочную жидкость, сохраняя образцы охлажденными на льду. После снятия последней промывки чайного буфера добавьте 500 микролитров свежеприготовленного буфера Люциса в вихрь бусин, чтобы смешать бусины в буфере Люциса и нагревать в течение 30 минут при температуре 65 градусов Цельсия.

Вортексируйте каждые 10 минут, пока образцы элюируются, разморозьте входные образцы и добавьте в каждый из них 500 микролитров элюирующего буфера. Включайте эти образцы во все последующие шаги. После того, как образцы закончат инкубацию при температуре 65 градусов Цельсия, происходит микросинтез каждые 30 секунд при 2000 оборотах в минуту и перенос EENT в новую микропробирку.

Наконец, переверните сшивку. Добавьте пять моляров хлорида натрия до конечной концентрации 200 миллимоляров во все образцы и поместите в вихревой инкубатор при температуре 65 градусов Цельсия на срок не менее четырех часов до ночи. После того, как поперечные сшивки иммунокомплексов поворачиваются вспять, связанная ДНК может быть восстановлена после завершения инкубации при температуре 65 градусов Цельсия.

Микрофуги образцов в течение 30 секунд. Чтобы собрать конденсат на крышках, добавьте по одному микролитру РНК А в каждую пробирку и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут после обработки РНК в каждой пробирке в количестве 10 микролитров 0,5 молярного ЭДТА, 40 микролитров 0,5 моло трис хлорида pH 6,5 и двух микролитров протеиназы К или всего 52 микролитра из мастер-смеси и инкубируйте при температуре 45 градусов Цельсия в течение 60 минут. Экстрагируйте образцы фенолхлороформом, изоспиртом, а затем хлороформом ISO A мой спирт.

Затем для осаждения ДНК добавьте два микролитра гликогена и 0,1 объема трех моляров ацетата натрия. pH 5,2 к каждому образцу и вихрю, добавьте 2,5 объема вихря 100% этанола и инкубируйте при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение ночи. Извлекайте образцы и микроотходы при 13 000 об/мин в течение 20 минут при четырех градусах Цельсия.

Промойте гранулы гликогена ДНК одним миллилитром 70% этанола и воздухом. Высушите гранулы или используйте скоростную вакуумную центрифугу. Не пересушивайте ДНК, повторно суспендируйте гранулы в 200 микролитрах TE-буфера и количественно не более одного микролитра в реальном времени.

Показанная здесь ПЦР представляет собой результаты эксперимента с чипом, следящим за динамикой H три, K 36 ME три. Во время индукции интерферона гамма антитела IRF один ген H three K 36 ME три использовали для снижения хроматина, собранного из двух клеток FTGH, индуцированных интерфероном гамма, в течение 30 минут, 1,5 часов и пяти часов с IgG в качестве отрицательного контроля. В эти же моменты времени определялась занятость STAT One, а также занятость РНК-полимеразы 2.

Занятость гистонов в локусе гена IRF one определяли для неиндуцированных и индуцированных состояний с использованием антитела pan-гистона 3, которое также служит положительным контролем. Провал в районе минус пяти пар оснований обусловлен истощением нуклеосом, которое обнаруживается в местах начала транскрипции. Мы только что показали вам процедуру иммунопреципитации хроматина.

Этот анализ полезен для наблюдения за модификациями хроматина, которые происходят во время транскрипции активированного гена. При выполнении этой процедуры важно отработать процедуру сдвига хроматина с помощью атора, прежде чем начинать эксперимент с чипом. Также не забудьте взять образцы входных данных.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.