Как культуре, запись и стимулировать нейронных сетей на микро-электрод массивы (МЭС)

Общая цель этой процедуры заключается в культивировании, регистрации и стимуляции нейронных сетей на микроэлектродных решетках. Это достигается путем предварительной подготовки реагентов и микроэлектродных матриц к культивированию. Вторым этапом процедуры является диссоциация корковых нейронов из эмбриона крысы на 18-й день.

Третьим этапом процедуры является наложение микроэлектродов на микроэлектродные матрицы и культивирование в течение двух-трех недель. Заключительным этапом процедуры является экспериментирование с нейронными сетями путем стимуляции и записи с микроэлектродных матриц. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые демонстрируют спонтанную и вызванную стимулом активность в нейронных сетях с помощью программного обеспечения для записи и стимуляции путем тщательного культивирования клеток на микроэлектродных массивах.

Здравствуйте, я профессор Стив Поттер. Я являюсь директором лаборатории нейроинженерии на факультете культуры биомедицинской инженерии в Технологическом институте Джорджии. Этот факультет находится в совместном использовании с Медицинской школой Университета Эмори.

Меня зовут Чад Хейлз, я работаю постдоком в лаборатории доктора Поттера. Я также являюсь научным сотрудником по когнитивно-поведенческому поведению на кафедре неврологии в Медицинской школе Университета Эмори. Сегодня мы покажем вам, как культивировать и ухаживать за нейронами на многоэлектродных решетках.

Вот такие. Мы используем их для изучения обучения и памяти in vitro и обработки сетевой информации. Итак, приступим к работе В ламинарном проточном колпаке начните подготовку многоканальных систем микроэлектродной матрицы или пипетки МЭА 100 микролитров полиэтиленамина в центр чистой и стерильной МЭА, отдыхающей в 100-миллиметровой чашке Петри, чтобы не повредить электроды.

Никогда не прикасайтесь к твердым предметам к поверхности MEA. Слегка накрываем тарелку стерильной крышкой, снабженной газопроницаемой тефлоновой мембраной и выдерживаем в вытяжке в течение 30 минут. Крышка из тефлоновой мембраны обеспечивает газообмен с минимальным испарением и возможностью культивирования в условиях более низкой влажности.

Более низкая влажность позволяет использовать в инкубаторе деликатную электронику и снижает уровень загрязнения. Отсадите PEI, промойте MEA три раза одним-двумя миллилитрами стерильной деионизированной воды. Дайте им высохнуть при снятой крышке в вытяжке не менее 30 минут или пока они полностью не высохнут.

Завершите диссоциацию корковых нейронов E 18, как описано в текстовой части данного протокола. Процедите клетки после процеживания. Переложите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 15 миллилитров и осторожно доведите объем клеточной суспензии до четырех миллилитров с помощью клеточной среды.

Нанесите слой 500 микролитров 5%-ного раствора BSA под центрифугу клеточной суспензии при давлении 200 G в течение шести минут. Пока клетки вращаются, убедитесь, что МЭА полностью сухие. Осторожно нанесите пипеткой 20 микролитров раствора ламината в центр МЭА.

Избегайте попадания пузырьков воздуха и убедитесь, что все электроды закрыты. Аккуратно положите тефлоновую крышку на MEA, чтобы предотвратить испарение ламинина. MEA должен находиться на абсолютно ровной поверхности, когда крышка установлена.

В противном случае давление может треснуть стеклянное дно массива. Выдерживайте чашку при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, 9% кислорода и влажности 65% в течение 20 минут. Теперь переложите закрученные ячейки в капот.

На дне пробирки должна быть видна клеточная гранула. Удалите и оставьте надосадочную жидкость на случай неполного гранулирования. Аккуратно ресуспендируйте гранулу.

Посчитайте количество клеток в 10 микролитрах суспензии на цитометре гемоцитометра и разведите суспензию до нужной концентрации. Обычно от 1000 до 3000 клеток на микролитр с клеточной средой. Когда инкубация ламината будет завершена, немедленно удалите каплю.

Пипеткой нанесите от 15 до 20 микролитров клеточной суспензии на покрытую ламинатом область MEA. Накройте посуду тефлоновой крышкой и поставьте в инкубатор на 30 минут. Под фазово-контрастным микроскопом осмотрите чашку, чтобы убедиться, что клетки прилипли и покрыли все электроды.

Если охват неполный, добавьте больше клеток и повторите инкубацию. Медленно залейте посуду одним миллилитром подогретой уравновешивающей клеточной среды. Установите на место тефлоновую крышку и поместите блюдо обратно в инкубатор на 24 часа.

На следующий день. Под фазово-контрастным микроскопом убедитесь, что культивируемые клетки прилипли и что количество мусора и гибель клеток ограничены при надлежащем уходе и питании. Как поясняется в сопроводительном тексте, нейроны, культивируемые таким образом, могут выжить более года.

Через две-три недели культуры достигли устойчивого состояния активности и могут быть записаны из этого видео, теперь будет продемонстрировано запись с помощью специально созданной программы нейрописателя. Перенесите чашку в регистрирующий инкубатор при температуре от 35 до 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, 9% кислорода и 65% влажности. Чтобы поддерживать идеальную температуру и pH, при перемещении посуды передвигайте ее параллельно земле и избегайте быстрых движений, которые могут выбить клетки из субстрата.

Извлеките MEA из чашки и поместите его в многоканальные системы. Записывая усилитель preem, убедитесь, что внутреннее заземление правильно согласовано с заземлением усилителя Preem. Предварительный усилитель расположен на шкуре, которая функционирует для рассеивания тепла, как описано в сопроводительном тексте здесь, предварительный усилитель был перемещен из инкубатора.

Лучше покажите правильную посадку блюда. Используйте салфетку, смоченную в 70% этаноле, для очистки контактов по периметру массива. Убедитесь, что MEA правильно установлен ниже, и зафиксируйте крышку.

При необходимости с помощью ватной палочки совместите контакты массива. В neuro writer выберите настройки, подходящие для эксперимента. Переключатель записи должен быть поднят вверх.

Чтобы записать данные в файл, нажмите кнопку «Пуск», чтобы начать запись. На экране с пиками теперь будут отображаться бегущие следы активности и фоновый шум с редкими потенциалами действий и всплесками активности. Если электрод излучает слишком сильный шум, возможно, на крышке предварительного усилителя находится смещенный контакт, небольшой кусочек мусора, капля среды, поврежденная поверхность электрода или перекрывающаяся прозрачная мембрана от крышки, нарушающая контакт

Проверьте контактный штифт и при необходимости отрегулируйте ватным тампоном, смоченным в 70% этаноле. Нажмите на вкладку формы сигнала спайка, чтобы переключить вид экрана в режим обнаружения спайков, в котором потенциалы действия отображаются в статических окнах длиной три миллисекунды. Чтобы стимулировать нейронную сеть на MEA, обучите алгоритм сальпы на вкладке настроек записи, чтобы ограничить артефакт стимуляции, активируйте сальпу на вкладке онлайн-настроек.

После начала записи нажмите на вкладку STEM, чтобы настроить подходящую парадигму стимуляции, чтобы использовать программу с разомкнутым контуром для стимуляции одного электрода и наблюдать за реакцией в чашке. Выберите подходящие настройки в разделе разомкнутого цикла и нажмите кнопку «Пуск». Визуализируйте отклики на главной вкладке спайков и на вкладке форм волны спайков.

В этом фильме показано, как в пробирке развиваются семь нейронов и глиальные клетки, которые растут и образуют связанную сеть на MEA, где видны микроэлектроды. Это растровый график двухминутной спонтанной активности нейронной сети. Каждая черная точка представляет собой потенциал действия.

Два всплеска активности обозначены синими стрелками. Отклик на несколько электродов является функцией подключения к сети. Вот растровый график 16-секундной активности, вызванной стимулом.

Красные звезды обозначают раздражители. Красными стрелками показаны пять стимулов, которые успешно индуцировали всплески синаптической активности на нескольких электродах. Иногда стимул не приводит к взрыву.

Здесь, на синей стрелке, мы только что показали вам, как культивировать, записывать и стимулировать нейронные сети на микроэлектродных массивах. Вероятно, самое важное, о чем нужно беспокоиться, — это предотвратить заражение культур и уменьшить испарение. Если использовать крышки с полупроницаемыми мембранами, как эта, они герметичны и предотвращают испарение и инфекцию, и вы можете культивировать культуры в течение месяцев, возможно, даже более года.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.