DiOLISTIC Маркировка нейроны от грызунов и не-человека Предстоятель фрагменты мозга

Мы демонстрируем использование генной пушки ввести флуоресцентными красителями, например, DII, в нейроны в мозге ломтики от грызунов и не-человеческое приматов разных возрастов. В данном конкретном случае мы используем взрослых мышей (3-6 месяцев) и взрослых cynomologus обезьян (9-15 лет). Этот метод, впервые описана в лаборатории доктора Лихтман (Ган

Меня зовут Гейл Сибель, и я являюсь научным сотрудником лаборатории доктора Вероники Альварес в Национальном институте по борьбе со злоупотреблением алкоголем и алкоголизмом. Эта работа была выполнена в сотрудничестве с доктором Кэтлин Грант и Эндрю Воу из Орегонского центра приматов и доктором Джеймсом Деном из Университета Уэйк Форест, которые предоставили нечеловеческую ткань примата, использованную в этом исследовании. Цель этой процедуры состоит в том, чтобы ввести флуоресцентные красители в нейроны и пометить участки мозга различных видов, таких как грызуны и приматы любого возраста.

С целью изучения морфологии дендритов и дендритных шипиков это достигается путем предварительного покрытия Ts и бусин липофильным красителем, таким как D-глаз. Второй шаг процедуры заключается в том, чтобы выровнять трубку бусинами с D-образным покрытием и разрезать ее на мелкие кусочки, которые служат пулями для системы генной пушки Helios. Третий шаг процедуры заключается в том, чтобы выстрелить покрытыми глазом шариками D в срезы мозга с помощью генной пушки.

Заключительный этап процедуры является необязательным, так как стилистику можно сочетать с иммуноокрашиванием для одновременной локализации других маркеров. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают разреженную флуоресцентную маркировку нейронов, пригодную для визуализации с высоким разрешением, такой как конфокальная или двухфотонная микроскопия, а также изучение дендритного ветвления и морфологии дендритных шипиков. Основное преимущество этой методики перед существующими нами методиками заключается в том, что стилистика может быть применена к срезам мозга животных всех видов, возрастов и генотипов.

Его можно использовать в сочетании с иммуноокрашиванием и производить разреженную флуоресцентную маркировку, которая подходит для микроскопии с высоким разрешением Перед изготовлением пуль. Покройте шарики вольфрама липофильным красителем в химическом вытяжном шкафу из расчета 450 миллилитров метиленхлорида до 13,5 миллиграммов липофильного красителя глаз для получения конечной концентрации 30 миллиграммов на миллилитр. Возьмите одну предварительную трубку Eloqua, содержащую 300 миллиграммов вольфрамовых шариков, и добавьте в нее 300 микролитров метиленхлорида трубки, энергично пересуспендируйте шарики и сделайте однородный раствор.

На один набор пуль используется всего 100 миллиграммов вольфрамовых шариков, пипетирование вверх и вниз, чтобы сохранить бусины в ресуспензии, добавление 100 миллилитров шариков и растворенного глазка штампа на предметное стекло и тщательное перемешивание их вместе. С помощью наконечника для пипетки дайте полностью высохнуть на воздухе, пока шарики не станут светло-серыми. Положите чистый лист вощеной белой бумаги под предметное стекло с помощью чистого лезвия гонщика Для каждого цвета пуль соскребите бусины со стекла, проведите и нарежьте их кубиками в мелкий порошок.

Соскребите покрытые бусины на сывороточную бумагу и сверните их в коническую трубку объемом 15 миллилитров. Добавьте три миллилитра воды и обработайте ультразвуком на водяной бане от 10 до 30 минут при комнатной температуре, чтобы тщательно разрушить любые комочки. Отрежьте 0,7 метра бирюзовой трубки под углом на одном конце и подсоедините другой конец к шприцу объемом 12 миллилитров с помощью адаптера для трубок, поместите свободный конец в трубку, содержащую 10 миллилитров поливинилперона или раствора ПВП со скоростью 10 миллиграмм на миллилитр, и полностью наберите раствор через трубку и в шприц.

Вихревой раствор шариков во время откачки с помощью шприца для получения однородной смеси, работающей быстро, во избежание выпадения шариков в осадок, полностью втяните раствор в трубку. Избегайте попадания пузырьков воздуха, которые не позволят шарикам прикрепиться к трубке в этом месте, при этом трубка будет натянута с обоих концов. Наклоняйте его из стороны в сторону равномерно.

Распределите бусины. Подайте трубку в подготовительную станцию и дайте шарикам осесть в течение 30-60 секунд. Используйте шприц медленно, но плавно.

Удалите воду, оставив бусины. Немедленно отсоедините шприц и начните вращать трубку. Отрегулируйте расход азота на подготовительной станции на четыре-пять литров в минуту. Сушите в течение 10-20 минут, пока капли воды не перестанут быть видимыми.

Снимите трубку с подготовительной станции, разрежьте пули на 13 миллиметровых отрезков с помощью резака для трубок, и на хороших пулях будет слабая серая дымка, равномерно покрывающая внутреннюю часть. Поместите пули в сцинтилляционные флаконы, обернутые фольгой, содержащие подсушивающий агент, такой как безводный сульфат кальция. Храните его при комнатной температуре до готовности к съемке.

Diic Labeling может быть использован для окрашивания нейронов в тканях мозга различных видов и возрастов и сохранен с помощью различных методов. Поместите кусочки мозга, которые были зафиксированы до или после разрезания, в лунки 24. Колодец пластина.

Промойте ломтики одним XPB S3 раза в течение пяти-10 минут за промывку. Пипетка с PBS с помощью кисти центрирует срез в лунке. Поместите кусок фильтра 3,0 микрометра между двумя металлическими диффузионными экранами на конце гильзы ствола генного пистолета.

Держите генную пушку так, чтобы конец гильзы ствола находился на расстоянии 1,5 сантиметра от образца. Выстрелите в бусины с давлением газообразного гелия от 120 до 180 фунтов на квадратный дюйм. Быстро промойте ломтики три раза одним XPBS, чтобы удалить лишний краситель.

Убедитесь, что поверхность среза должна быть обращена вверх во время всех этапов работы с жидкостью. Храните ломтики в PBS от трех до шести часов, чтобы позволить DAI распространиться по дендритам, покрытым фольгой. Поскольку dai является светочувствительным, срезы могут быть установлены на этой стадии или подвергнуты дальнейшему окрашиванию антителами, как подробно описано в следующем разделе, чтобы продолжить окрашивание от 300 до 500 микролитров проникающего раствора, содержащего 0,01% TRITTON X 100 в одном XPBS на каждый срез, инкубировать при комнатной температуре ровно 15 минут.

Удалить проникающий раствор из лунок, заблокировать срезы в растворе, содержащем 10%козью сыворотку и 0,01%тритана Х 100 в одном XPBS, инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте в каждую от 300 до 500 микролитров первичного антитела, разведенного в блокирующем растворе. Хорошо инкубировать при комнатной температуре в течение одного-двух часов или в течение ночи, в зависимости от антител промыть срезы трижды по одному XPBS в течение пяти-15 минут на каждой промывке, удалить раствор из лунки.

Добавьте в каждую от 300 до 500 микролитров вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе. Хорошо промойте четыре раза одним XPBS в течение пяти-15 минут, каждое мытье, как и раньше, закрепите ломтики на предметном стекле с флуоресцентным монтажным материалом и накройте 18 на 18 миллиметров. Чехол для чехла дайте высохнуть от шести до 12 часов при комнатной температуре, прежде чем запечатать края прозрачным лаком для ногтей, хранящимся в темноте или накрытым при температуре четыре градуса Цельсия.

Здесь приведены примеры изображений помеченных участков мозга. Две важные характеристики, на которые следует обратить внимание, — это разреженный шаблон мечения при малом увеличении и способность идентифицировать отдельные клеточные компоненты. Неправильная подготовка пуль или чрезмерная фиксация ткани может привести к плохой маркировке, как показано здесь.

Советы по устранению неполадок приведены в тексте здесь. Имеется конфокальное изображение среднего спинового нейрона TAL из мозга мыши и его сложного паттерна дендритного ветвления. Оптическое срезирование, полученное при использовании конфокальной микроскопии, позволяет выделить одиночные меченые клетки в тканевом срезе.

На изображениях с большим увеличением видны дендритные сегменты мозга грызуна и мозга примата. Обратите внимание, что высокая интенсивность флуоресцентного окрашивания, достигаемая с помощью этого метода, приводит к хорошо выраженным дендритным шипам при сочетании ИКС с иммуноокрашиванием. На этом изображении показан пример колокализации мечения глаза D красным цветом с иммуноокрашиванием для экспрессии GFP зеленым цветом.

Это изображение соответствует срезу sal трансгенной мыши, экспрессирующей флуоресцентный белок GFP под промотором дофаминового рецептора Done. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как правильно готовить пули и использовать пистолет Цзин для малоподверженных воздействию нейронов флуоресцентными красителями. Этот метод позволяет четко визуализировать морфологию нейронов и изучать ветвления и шипы.