DiOLISTIC Маркировка нейроны от грызунов и не-человека Предстоятель фрагменты мозга

Меня зовут Гейл Сибел, я postdoctoral fellow в лаборатории доктора Вероники Альварес в Национальном институте по изучению злоупотребления алкоголем и алкоголизма. Эта работа была выполнена в сотрудничестве с доктором Кэтлин Грант и Эндрю Вау из Орегонского центра приматов, а также с доктором Джеймсом Дином из Университета Уэйк-Форест, который предоставил ткани приматов, использованные в данном исследовании. Основная цель данной процедуры заключается во введении флуоресцентных красителей в нейроны и маркировке срезов мозга различных видов, таких как грызуны и приматы любого возраста.

Для изучения морфологии дендритов и дендритных шипиков сначала проводят окрашивание Ts и микросфер липофильным красителем, таким как D eye. На втором этапе процедуры внутреннюю поверхность трубки выстилают микросферами, покрытыми D eye, после чего разрезают её на небольшие фрагменты, которые служат «пулями» для системы генной пушки Helios. На третьем этапе процедуры с помощью генной пушки микросферы, покрытые D eye, вводят в срезы мозга.

Заключительный этап процедуры является необязательным, так как стилистику можно сочетать с иммуноокрашиванием для одновременной локализации других маркеров. В итоге можно получить результаты с редким флуоресцентным мечением нейронов, подходящим для визуализации с высоким разрешением, такой как конфокальная или двухфотонная микроскопия, а также для изучения ветвления дендритов и морфологии дендритных шипиков. Основным преимуществом этого метода по сравнению с нашими существующими методами является то, что стилистику можно применять к срезам мозга животных всех видов, возрастов и генотипов.

Этот метод может быть использован в сочетании с иммуноокрашиванием и обеспечивает редкое флуоресцентное мечение, подходящее для микроскопии высокого разрешения. Перед приготовлением микросфер покройте вольфрамовые бусины липофильным красителем в вытяжном шкафу, используя 450 мл дихлорметана на 13,5 мг липофильного красителя для достижения конечной концентрации 30 мг/мл. Возьмите одну пробирку, содержащую 300 мг вольфрамовых бусин, и добавьте 300 µL дихлорметана; интенсивно перемешайте раствор пипеткой для ресуспендирования бусин и получения гомогенного раствора.

На один набор пуль используется всего 100 milligrams вольфрамовых гранул; чтобы поддерживать их во взвешенном состоянии, выполняйте перемешивание пипетированием вверх-вниз, затем нанесите 100 milliliters гранул и растворенного красителя на предметное стекло и тщательно перемешайте их. С помощью наконечника пипетки дайте смеси полностью высохнуть на воздухе, пока гранулы не станут светло-серыми. Поместите под предметное стекло чистый лист вощеной белой бумаги и с помощью чистого лезвия бритвы сгребите гранулы с стекла, измельчив их в тонкий порошок для каждого цвета пуль.

Соберите покрытые бусины со специальной фильтровальной бумаги и перенесите их в коническую пробирку объемом 15 мл. Добавьте 3 мл воды и подвергните воздействию ультразвука в водяной бане в течение 10–30 минут при комнатной температуре для полного разрушения всех комков. Отрежьте 0,7 м бирюзовой трубки, сделав один конец скошенным, и соедините другой конец с шприцем объемом 12 мл с помощью адаптера для трубок; поместите свободный конец в пробирку, содержащую 10 мл раствора поливинилпирролидона (PVP) с концентрацией 10 мг/мл, и полностью наберите раствор через трубку в шприц.

Перемешайте раствор с гранулами на вортексе, одновременно прокачивая его шприцем для получения гомогенной смеси; действуйте быстро, чтобы избежать выпадения гранул в осадок, и полностью наберите раствор в трубку. Избегайте попадания пузырьков воздуха, так как они помешают прикреплению гранул к трубке в этом месте, при этом удерживайте трубку натянутой с обоих концов. Наклоняйте её из стороны в сторону для равномерного распределения.

Распределите бусины. Вставьте трубку в станцию подготовки и дайте бусинам осесть в течение 30–60 секунд. С помощью шприца действуйте медленно, но плавно.

Удалите воду, оставив в системе гранулы. Немедленно отсоедините шприц и начните вращать трубку. Отрегулируйте поток азота на подготовительной станции до 4–5 LPM сухого газа и поддерживайте его в течение 10–20 минут, пока капли воды не исчезнут.

Снимите трубку с подготовительной станции, разрежьте её на сегменты длиной 13 миллиметров с помощью трубореза; качественные сегменты будут иметь равномерный светло-серый налет на внутренней поверхности. Поместите сегменты в обернутые фольгой сцинтилляционные флаконы, содержащие осушающий агент, например, безводный сульфат кальция. Храните при комнатной температуре до начала облучения.

Маркировку Diic можно использовать для окрашивания нейронов в тканях головного мозга различных видов и возрастов, зафиксированных разными методами. Поместите срезы головного мозга, которые были зафиксированы либо до, либо после нарезания, в лунки 24-луночного планшета.

Промойте срезы в 1X PBS 3 раза по 5–10 минут за каждую промывку. Удалите PBS пипеткой и с помощью кисточки центрируйте срез в лунке. Поместите кусочек фильтра с размером пор 3.0 µm между двумя металлическими диффузионными экранами на конце вкладыша ствола генной пушки.

Держите генную пушку так, чтобы конец вкладыша ствола находился на расстоянии 1,5 сантиметров от образца. Выстрелите микросферами в срез при давлении газообразного гелия от 120 до 180 PSI. Быстро промойте срезы трижды раствором 1 XPBS, чтобы удалить излишки красителя.

Убедитесь, что во время всех этапов работы с жидкостями поверхность среза с местом воздействия остается обращенной вверх. Храните срезы в PBS от трех до шести часов, чтобы DAI мог распространиться по дендритам, накрыв их фольгой. Поскольку DAI чувствителен к свету, на данном этапе срезы можно закрепить на предметном стекле или подвергнуть дальнейшему окрашиванию антителами, как подробно описано в следующем разделе; для проведения окрашивания добавьте по 300–500 µL пермеабилизирующего раствора, содержащего 0,01% TRITON X 100 в 1xPBS, к каждому срезу и инкубируйте при комнатной температуре ровно 15 минут.

Удалите раствор для пермеабилизации из лунок, затем заблокируйте срезы в растворе, содержащем 10% сыворотки козы и 0,01% Triton X-100 в 1X PBS; инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут. Добавьте в каждую лунку от 300 до 500 µL первичных антител, разведенных в блокирующем растворе; инкубируйте при комнатной температуре от одного до двух часов или в течение ночи, в зависимости от используемых антител. Промойте срезы трижды в 1X PBS по 5–15 минут на каждую промывку, после чего удалите раствор из лунки.

Добавьте от 300 до 500 microliters вторичного антитела, разведенного в блокирующем растворе, в каждую лунку. Промойте четыре раза по одному XPBS в течение пяти-15 минут за каждую промывку, как описано ранее, закрепите срезы на предметном стекле с помощью флуоресцентной среды для заключения и накройте покровным стеклом размером 18 by 18 millimeter. Оставьте до высыхания на шесть-12 часов при комнатной температуре, после чего загерметизируйте края прозрачным лаком для ногтей; храните в темноте или в закрытом виде при температуре four degrees Celsius.

Здесь представлены примеры изображений маркированных срезов мозга. Двумя важными характеристиками, на которые следует обратить внимание, являются редкий паттерн маркировки при малом увеличении и возможность идентификации отдельных клеточных компонентов. Неправильное приготовление микросфер или чрезмерная фиксация ткани могут привести к плохой маркировке, как показано здесь.

Советы по устранению неполадок приведены в данном тексте. Представлено конфокальное изображение спинозного нейрона из среды TAL, взятого из мозга мыши, и сложный паттерн его дендритного ветвления. Оптическое секционирование, достигаемое при использовании конфокальной микроскопии, позволяет изолировать отдельные меченые клетки в срезе ткани.

Изображения с большим увеличением демонстрируют сегменты дендритов мозга грызуна и мозга примата. Обратите внимание на высокую интенсивность флуоресцентного окрашивания, достигнутая с помощью данного метода, что при сочетании ICS с иммуноокрашиванием позволяет получить четко выраженные дендритные шипики. На этом изображении представлен пример колокализации маркировки D eye красным цветом с иммуноокрашиванием на экспрессию GFP зеленым цветом.

На этом изображении представлен срез сагиттальной плоскости трансгенной мыши, экспрессирующей флуоресцентный белок GFP под промотором дофаминового рецептора D1. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как готовить микроинъекционные смеси и использовать пистолет для микроинъекций (Jing gun) для разреженного мечения нейронов флуоресцентными красителями. Этот метод позволяет четко визуализировать морфологию нейронов, а также изучать ветвление дендритов и шипики.