Дифференциальная изображений биологических структур с Вдвойне-резонансной когерентного антистоксова рассеяния света (КАРС)

В данном видео демонстрируется методика дифференциальной визуализации двух рамановских резонансов, связанных с биологическими структурами с когерентными сигналами рамановского рассеяния. Сначала три синхронизированных короткоимпульсных лазера перекрываются во времени и пространстве. Затем перекрывающиеся импульсы направляются в стандартный инвертированный микроскоп, что позволяет генерировать когерентные рамановские сигналы от микроскопических объектов.

Сигналы преобразуются в изображения с помощью коммерческого программного обеспечения для сравнения различных генерируемых рамановских сигналов. Результаты показывают, что разность между изображениями, полученными с использованием двойного и одинарного рамановского резонанса, обеспечивает повышенную чувствительность к слабым рамановским сигналам. Здравствуйте, я Тайлер Уикс из Центра биофотоники Калифорнийского университета в Дэвисе.

Меня зовут Томас ER, я представляю Центр биофотоники и отделение внутренних болезней Калифорнийского университета в Дейвисе. Сегодня мы продемонстрируем процедуру использования двухрезонансного когерентного антистоксова рамановского рассеяния для получения химически специфических изображений клеток. Мы используем эту процедуру для регистрации сигналов от молекул, которые слишком слабы, чтобы их можно было обнаружить непосредственно с помощью одной только когерентной антистоксовой рамановской спектроскопии.

Итак, приступим. Для одновременной генерации сигналов CARS и Dr CARS требуются три перестраиваемых и синхронизированных источника коротких лазерных импульсов. Для получения этих синхронизированных импульсов начните с одного короткоимпульсного лазера с выходной мощностью 10 watts, фиксированной длиной волны 1064 nanometers, фиксированной длительностью импульса 7 picoseconds и фиксированной частотой повторения 76 megahertz.

С помощью серии полуволновых пластинок и поляризационных светоделителей пучок разделяется на три части. Сочетание полуволновой пластинки с поляризационным светоделителем позволяет регулировать мощность каждой составляющей пучка без изменения его направления. Обычно два пучка настраивают примерно на 4.5 watts каждый, а третий пучок содержит оставшийся один watt.

Затем два высокомощных пучка направляются в два независимых оптических параметрических осциллятора (ОПО). В ОПО используется процесс генерации различных частот для преобразования одного высокоэнергетического фотона в два фотона с меньшей энергией и разными длинами волн. Путем контроля температуры кристалла, используемого для достижения этого эффекта, можно регулировать длину волны результирующих фотонов с точностью до 0,1 nanometers.

Путем удвоения частоты этих сигналов лазер с фиксированной длиной волны 1064 нанометров теперь может быть преобразован в лазерный луч, перестраиваемый в любом диапазоне от 780 нанометров до 910 нанометров за счет накачки двух отдельных ОПО одним и тем же источником с длиной волны 1064 нанометров. В результате получаются два независимо перестраиваемых лазерных источника, которые автоматически синхронизированы с исходным лазером накачки. Третий луч от лазера накачки с длиной волны 1064 нанометров направляется в обход ОПО с помощью комбинации диэлектрических зеркал, чтобы все три луча могли быть впоследствии объединены.

Для эффективной генерации когерентных фотонов рамановского сигнала рекомбинированные импульсы должны перекрываться как во временном, так и в пространственном аспектах, поскольку ОПО содержат кольцевые резонаторы, позволяющие каждому лазерному импульсу проходить через кристалл несколько раз; при этом луч, направляемый через ОПО, проходит дополнительное расстояние, что приводит к значительной задержке относительно исходного пучка накачки. Эту дистанцию необходимо компенсировать с помощью третьего луча, установив дополнительные зеркала, которые заставляют этот луч проходить такое же расстояние, как и два других, перед их рекомбинацией с помощью дихроичных зеркал для обеспечения точной настройки длины пути. Каждый луч направляется через регулируемые delaying-стадии, которые позволяют настраивать временное перекрытие различных лазерных импульсов.

Для возможности независимой регулировки мощности каждого лазерного луча в каждый из них добавляются еще один набор полуволновых пластинок и кубических поляризационных светоделителей. С помощью дихроичных зеркал сначала объединяются лучи от двух OPO, а затем — луч с длиной волны 1064 нанометра; при этом необходимо обеспечить точное пространственное перекрытие лучей. Правильность перекрытия можно проверить, сравнив взаимное расположение лучей на расстоянии нескольких сантиметров от дихроичного зеркала и примерно в одном метре от него.

Поскольку воздействие лазерных пучков с высокой средней мощностью может повредить образец, три объединенных пучка направляются через электрооптический модулятор, выполняющий функцию селектора импульсов (pulse picker), что позволяет регулировать частоту повторения импульсов, поступающих на образец, и, следовательно, среднюю мощность. Затем объединенные лазерные пучки вводятся в инвертированный микроскоп с объективом с высокой числовой апертурой (NA). Сильная фокусировка, обеспечиваемая объективом с высокой NA, позволяет наиболее эффективно генерировать когерентные рамановские сигналы на микроскопических пространственных масштабах.

Объектив микроскопа установлен на пьезоэлектрическом столике с перемещением по осям X, Y, Z, что позволяет получать изображения путем растрового сканирования образца пучками, аналогично коммерческим конфокальным микроскопам со сканированием пучка. Теперь рассмотрим, как генерируются сигналы CARS и DRFWM: взаимодействие трех короткоимпульсных лазерных пучков в образце приводит к генерации нескольких сигналов четырехволнового смешения, таких как CARS от различных комбинаций двух лазеров, а также трехцветных сигналов CARS и DR CARS от комбинации всех трех лазеров. Когда сигналы имеют близкие длины волн, их разделение для анализа может быть затруднительным.

По этой причине сигналы подаются в спектрометр с визуализацией, который также служит монохроматором или полосовым фильтром для пространственного разделения сигналов на разных длинах волн. Электронно-приводимое поворотное зеркало внутри спектрометра в опущенном положении направляет сигнал на камеру с прибором с зарядовой связью (ПЗС-камерой) с глубоким обеднителем и обратной засветкой, которая предоставляет спектроскопическую информацию во всем диапазоне сигналов и позволяет идентифицировать и оптимизировать различные когерентные сигналы ротона для выбора сигнала, подлежащего визуализации. Для центрирования интересующего пика на ПЗС-камере просто поверните дифракционную решетку внутри спектрометра, используя supplied supplied программное обеспечение для управления и сбора данных от производителя.

Затем измените положение поворотного зеркала, чтобы перенаправить сигнал во второй выходной порт, к которому подключен лавинный фотодиод (APD) для счета одиночных фотонов или фотодетектор (PD). Выполните растровое сканирование объективом, а затем используйте сигналы, зарегистрированные на APD, для формирования изображения с помощью программного обеспечения для сбора данных, отображая скорость счета фотонов для каждого пикселя. Повторите эту процедуру визуализации для каждого необходимого когерентного рамановского сигнала, чтобы иметь возможность сравнить сигналы в процессе последующей обработки.

Теперь рассмотрим, как правильно подготовить образец для получения четких и воспроизводимых изображений. При подготовке образцов необходимо соблюдать определенные меры предосторожности. Как правило, образцы готовят на стеклянных покровных стеклах толщиной примерно 150 micron.

Данные покровные стекла достаточно тонкие, чтобы обеспечить получение изображений с высоким разрешением при использовании иммерсионных объективов с высокой NA (водных или масляных), которые применяются в этих экспериментах. Чтобы продемонстрировать подготовку типичного образца, мы готовим срезы мышечной ткани мыши толщиной примерно 20 micron, которые закрепляются на предметном стекле микроскопа. К образцу добавляют каплю 20 µL пятимолярного раствора дейтерированной глюкозы.

Раствор дейтерированной глюкозы обеспечивает уникальный и интенсивный фоновый сигнал рамановского рассеяния. На образец помещают стеклянную покровную пластинку и фиксируют ее лаком для ногтей, подходящим для работы с клетками и культурами. Можно использовать культуральные чашки со стеклянным дном, что позволяет проводить визуализацию без необходимости отделять клетки от их культуральных сосудов.

Теперь давайте разберем, как определить подходящие рамановские пики для Dr cars. Для того чтобы эффективно использовать эффект двойного резонансного усиления, необходимо знать рамановские спектры обоих резонансных веществ. Как правило, это 2 845 см⁻¹, соответствующие липидам, и 2 121 см⁻¹ для моды растяжения связи C-D, соответствующей дейтерированной глюкозе.

Когерентное рамановское рассеяние достигается, когда разность частот двух лазеров совпадает с частотой молекулярного колебания. При настройке одного ОПО на 817 нанометров он будет зондировать моду C с частотой 2 845 обратных сантиметров в сочетании с лазерным лучом 1064 нанометра, а при настройке другого ОПО на 868 нанометров он будет зондировать частоту 2 121 обратных сантиметра в сочетании с лучом 1064 нанометра. В спектроскопическом режиме микроскоп CARS позволяет нам наблюдать три интересующих когерентных рамановских сигнала: сигнал CARS, зондирующий валентные колебания CH, сигнал CARS, зондирующий валентную моду CD, и сигнал DR CARS, зондирующий обе моды; на представленной здесь схеме пунктирными стрелками показаны фотоны лазеров в ОПО, а сплошными стрелками — результирующий сигнал.

Сплошные горизонтальные линии обозначают энергию рамановской вибрации и наглядно демонстрируют, что в DR-камерах одновременное смешивание одних и тех же трех входных фотонов позволяет зондировать две различные рамановские вибрации. Интенсивность сигнала для каждого пика потребуется оптимизировать путем точной настройки в окрестности положений этих пиков. Здесь мы выбираем каждый пик и получаем изображения морских червей sea elgan в растворе деградированной глюкозы; извлечение дополнительной информации на основе этих трех полученных по отдельности изображений требует довольно простой обработки изображений.

Сначала необходимо выполнить нормализацию изображений. Практический метод нормализации основан на гидрофобности липидов. Это означает, что в областях с высокой плотностью липидов вклад КД-резонанса глюкозы в сигнал двойного резонанса должен быть минимальным.

Напротив, в областях с чистым раствором глюкозы резонансы CH от липидов также должны вносить очень малый вклад. Исходя из этого, нормализуйте изображение DR-канала и изображение канала, полученное на CD-резонансе раствора дейтерированной глюкозы, по области, находящейся далеко за пределами C. elegans, где резонанс CH должен отсутствовать. Затем определите в изображении CH-резонансного канала область внутри червя, богатую липидами, и нормализуйте ее по соответствующей области в нормализованном изображении DR-канала.

Для корректной работы данного метода следует считать, что глубоко внутри этой области дейтерированная глюкоза отсутствует. Это допущение оправдано, так как липиды гидрофобны и не смешиваются с раствором. Таким образом, при вычитании нормализованного изображения CAR-сигнала резонанса CH из нормализованного изображения CAR-сигнала резонанса DR остается только усиленный резонансный сигнал CD; аналогичным образом при вычитании нормализованного изображения CAR-сигнала резонанса CD из нормализованного изображения Dr.FWM.

Здесь показан только усиленный резонансный сигнал CH; на данном графике представлен спектр КРС для модифицированной олеиновой кислоты с алкиновой модификацией. Сильные резонансы CH при 2 845 cm⁻¹ и алкиновый резонанс при 2 121 cm⁻¹ хорошо отделены от области «отпечатков пальцев» — области с плотным скоплением пиков, что делает их идеальными маркерами для когерентной КР-визуализации. Это типичный спектр когерентных КР-сигналов, возникающих при перекрытии в образце трех короткоимпульсных лазеров. Стрелки указывают на процессы, ответственные за каждый сигнал, в соответствии с энергетическими диаграммами.

Это типичные результаты визуализации червей C Elgin с использованием DR-CARS и CARS. В верхнем ряду использовались три только что показанных сигнала для получения изображения червя в растворе глюкозы с пониженной концентрацией. Во втором ряду изображения были соответствующим образом нормализованы, а в третьем ряду были получены разностные изображения путем вычитания каждого из CARS-изображений из DR-CARS-изображения. Мы только что продемонстрировали вам, как выполнять разностную рамановскую визуализацию на основе двухрезонансной когерентной антистоксовой рамановской микроскопии.

При выполнении данной процедуры помните, что важно обеспечить надлежащее перекрытие и синхронизацию пучков. Кроме того, при переключении между различными когерентными сигналами следите за тем, чтобы не задевать и не сдвигать образец, так как это повлияет на анализ. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.