Метод мышей Изоляция Островок и субкапсулярной трансплантации почек

Трансплантация глазниц была предложена в качестве потенциального метода лечения диабета первого типа. Тем не менее, два основных ограничения не позволяют ему стать широко распространенной клинической реальностью. Во-первых, на одного получателя необходимо большое количество люверсов.

Поскольку глазки получают от доноров органов, количество потенциальных реципиентов сильно ограничено. Вторая трансплантация требует пожизненного лечения сильными иммунодепрессантами, что подвергает пациента, особенно детскую популяцию, риску развития злокачественных новообразований, инфекций и почечной недостаточности. Трансплантация глазков под капсулу почки мыши проводится для изучения стратегий улучшения клинических результатов трансплантации.

Глазки, выделенные от здоровых мышей-доноров, были разделены на группы и подготовлены к трансплантации. Затем глазки пересаживаются в субкапсулярное пространство почки. У мышей-реципиентов с диабетом функция трансплантата глазков оценивается путем мониторинга уровня глюкозы в крови, который показывает, что примерно от 250 до 350 глазков восстанавливают гликемию у 20-граммовой мыши-реципиента в течение 24 часов после трансплантации.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для этапов канюляции. Общий желчный проток и перенос глазков в субкапсулярное пространство почки трудно поддаются изучению. Эти шаги требуют идентификации тканевых структур, твердых рук и использования техники, которая сводит к минимуму повреждение тканей.

Поместите усыпленную мышь в лежачем положении на бумажном полотенце у области препарирования и опрыскайте брюшную полость 70%-ным этанолом. С помощью ножниц вскройте живот с V-образным разрезом от лобковой области до обеих передних ног. Мышь находится ниже области препарирования.

Расположите его так, чтобы голова была направлена в сторону наблюдателя. Локализуйте дуоденальный вход в общий желчный проток с помощью зажима для гемостата, дуоденальное отверстие общего желчного протока. Гемостат должен быть расположен таким образом, чтобы при сжатии он проходил точно по границе поджелудочной кишки.

Здесь будут продемонстрированы два метода канюлирования желчного протока. Метод свободной руки и щипцы помогают канюлировать желчный проток. Используя метод свободной руки, потяните зажатый на двенадцатиперстной кишке кровоостанавливатель от головы мыши к хвосту так, чтобы общий желчный проток стал тугим.

В желчном протоке рядом с печенью происходит слияние, где желчь, стекающая из желчного пузыря, и ферменты из печени соединяются Прежде чем попасть в кишечник, плотно натяните желчный проток, чтобы обнажить внутреннюю часть V-образного положения. Изогнутая игла 27 калибра прикреплена к пятимиллилитровому шприцу таким образом, что игла скользит прямо через V-образную форму и напрямую канюлирует нижнюю часть протока. Сдвиньте иглу на несколько миллиметров за конец скоса, чтобы предотвратить обратный ток в печень и желчный пузырь.

Как только канюляция пройдет успешно, проперфузируйте поджелудочную железу, выпустив два миллилитра лиазы из шприца. Следите за расширением поджелудочной железы над животом как признаком оптимальной канюляции. В качестве альтернативы желчный проток может быть канюлирован.

С помощью метода кисты щипцом. Потяните зажатое на двенадцатиперстной кишке кровоостанавливающее средство С от головы мыши к хвосту так, чтобы общий желчный проток превратился в торчит. Затем с помощью изогнутой иглы 27 калибра, прикрепленной к пятимиллилитровому шприцу, проколите фасцию ниже общего желчного протока рядом с печенью.

С помощью иглы очистите фасцию от протока, не снимая иглу с места. Установите кровоостанавливатель вниз и возьмите в руки пару щипцов. Используйте одну руку открытых щипцов для поддержки желчного протока в том месте, где игла очистила фасцию, одновременно вытягивая проток и щипцы вперед.

Вставьте иглу в проток, используя щипцы в качестве ограничителя. Об успешном канюляции свидетельствует равномерное расширение области поджелудочной железы в верхней части желудка. После того, как поджелудочная железа была перфузирована, удалите кровоостанавливающее средство из двенадцатиперстной кишки.

Затем с помощью щипцов поднимите двенадцатиперстную кишку и с помощью второй пары щипцов отделите поджелудочную железу от кишечника. Затем освободите поджелудочную железу от верхней части желудка и селезенки. Наконец, поднимите поджелудочную железу из брюшной полости и освободите ее от оставшихся фасциальных соединений с кишечником, желудком и селезенкой.

Поместите поджелудочную железу в коническую трубку объемом 50 миллилитров и положите ее на лед. Инкубируйте поджелудочную железу при температуре 37 градусов Цельсия согласно инструкции в прилагаемом письменном протоколе. После инкубации добавьте в пробирки 20 миллилитров среды и диссоциируйте ткань, энергично встряхивая пробирки 40 раз за 10 секунд.

Этот шаг имеет решающее значение для оптимального восстановления фиалок. Спиновые ячейки составляют 800 вращений в минуту. Резус проводят в 15 миллилитрах среды и конденсируют образцы.

Вылейте ресуспензированную суспензию через проволочную сетку диаметром 0,419 миллиметра и сверните ее в свежую коническую трубку объемом 50 миллилитров. Первую пробирку промыть еще 10 миллилитров среды, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и влить через проволочную сетку гранулу в клетки методом центрифугирования реуса, согнуть гранулу в пяти миллилитрах ее непрозрачной 10 миллилитров комнатной температуры. Затем осторожно переведите вихрь в течение нескольких секунд, добавьте еще пять миллилитров его непрозрачного вокруг внутренней части трубки, чтобы смыть люверсы со стенки трубки, медленно пипеткой, чтобы наложить 10 миллилитров сыворотки без сыворотки RPMI вниз по боковой стороне трубки со скоростью один миллилитр за 10 секунд.

Четкий интерфейс должен быть очевиден. Затем вращайте образцы в центрифуге с качающимся ведром при температуре 20 градусов Цельсия и 900-кратной гравитации в течение 20 минут с очень медленным ускорением и без торможения после центрифугирования, островки будут отделены от экзокринных клеток с помощью одноразовой серологической пипетки объемом 10 миллилитров. Перенесите люверсы из интерфейса среды histo Paque в свежую коническую трубку объемом 50 миллилитров.

Несколько пробирок могут быть объединены в этот момент, чтобы удалить остатки глазков, его непрозрачные пробирки заполняют сывороткой, содержащей среду, и гранулируют островки, центрифугируя пробирки в течение двух минут со скоростью 800 оборотов в минуту. Затем реус суспендирует островки в свежих средах. Повторите этот шаг не менее двух раз. Реус.

Подвесьте поддон в пяти миллилитрах среды. Поместите 0,1-миллиметровый фильтр с нейлоновыми ячейками вверх дном на коническую трубку объемом 15 миллилитров. Проведите через него пипеткой суспензию из клеточной суспензии, чтобы собрать петельки.

Затем промойте 50 миллилитровую трубку с дополнительными шестью миллилитрами среды и пропустите ее через ситечко. Поместите три миллилитра капли медиума в 10-сантиметровую чашку Петри. Переверните клеточное ситечко и опустите его в каплю фильтрующего материала, чтобы собрать в люверсы, пипетку еще пять-семь миллилитров питательной среды через ситечко в чашку Петри.

Чтобы собрать оставшиеся проушины из ситечка под четырехкратным объективом, выберите проушины по отдельности с помощью пипетки P 200 и перенесите их в микропробирку объемом 1,5 миллилитров. На этих изображениях показаны люверсы, выделенные от 12-недельных мышей C 57 black six. Чистоту и качество люверсов можно оценить под микроскопом по завершении процедуры изоляции.

Например, на двух показанных здесь изображениях показано репрезентативное поле, в котором присутствуют обломки и загрязнение экзокринными клетками. Выбирая люверсы для эксперимента, избегайте загрязняющих экзокринных клеток или люверсов, которые кажутся нездоровыми. Люверсы с некротическими центрами нездоровы, как показано на этом рисунке, сделанном через 24 часа после изоляции, некротические центры не будут видны сразу после изоляции.

Глазки, которые являются отслаивающимися клетками, неизбежны и могут быть использованы для трансплантации глазков в этом 24-часовом видеоролике о глазках. Сразу после изоляции во многих глазках развиваются некротические центры. Эти некротические центры, по-видимому, выталкиваются из проушины ближе к концу записи во время перебирания проушин.

Сгруппируйте их так, чтобы каждая трубка имела равномерное распределение качества и размера люверсов. Например, каждая группа из 15 проушин может содержать четыре проушины большого размера, шесть средних проушин и пять маленьких проушин. Место. Трубку на ледяных люверсах можно использовать сразу для трансплантации или манипулировать.

Перед использованием. Поместите стерильный гелевый наконечник в отверстие 1,5-миллилитровой микроплавкой трубки так, чтобы был плавный изгиб, который образует U-образную форму на узком конце наконечника. Оба отверстия наконечника должны быть обращены прямо вверх из микромусорной трубки.

Аккуратно снимите трубку с люверсами изо льда. Убедитесь, что все люверсы расположились на дне трубки. С помощью пипетки P 200 аккуратно соберите люверсы в минимальном объеме со дна пробирки и перенесите их на подготовленный изогнутый наконечник.

После того, как проушины отстоятся, удалите как можно больше среды с наконечника, отсасывая среду через большое отверстие наконечника для загрузки геля с проушиной С помощью наконечника для загрузки свежего геля, прикрепленного к пипетке P 200. Прикрепите нескошенный конец трубки к узкому отверстию наконечника для загрузки геля на островковом подшипнике. Затем прикрепите наконечник к пипетке P 200 и осторожно вставьте островки в трубку.

Затем подсоедините нескошенный край трубки PE 50 к игле шприца Hamilton объемом 25 микролитров. С вынутым поршенем нажимайте на поршень шприца до тех пор, пока люверсы не окажутся примерно в 0,5 сантиметрах от скошенного отверстия. Отложите шприц в сторону так, чтобы проушины могли образоваться в единую массу возле скошенного отверстия трубки, пока почка готовится к приему проушин.

Подготовьте место операции, подстригая волосы и скрабируя кожу бетадином, чередуя его с 70% изопропиловым спиртом три раза. Начните процедуру трансплантации глазков с выполнения защемления пальцев ног для подтверждения анестезии у мыши-реципиента. Поместите стержень стеклянного стержня прямо под мышью и ниже почки перпендикулярно спинному мозгу.

Затем найдите почку через кожу и поместите стерильную хирургическую простыню. Как только почка будет найдена, с помощью ножниц McFerson banis сделайте двухсантиметровый разрез через дерму прямо над ней перпендикулярно спинному мозгу. Этот разрез обнажит стенку брюшины ножницами.

Сделайте разрез в один сантиметр через стенку брюшины в том же направлении, что и разрез через дермальный слой, используя стержень стеклянного стержня в качестве ограничителя, протолкните почку через брюшное отверстие, надавливая на прилегающую поверхность. Смочите поверхность обнаженной почки ледяным, стерильным PBS с помощью аппликатора с ватным наконечником. Повторяйте этот шаг каждые несколько минут по мере необходимости, чтобы предотвратить высыхание капсулы почки.

С помощью иглы 27 калибра сделайте разрез 0,2 сантиметра через капсулу почки через переднюю поверхность почки. Двигаясь от левой боковой стороны к правой боковой стороне, вставьте стеклянную капиллярную трубку, вытянутую пламенем. Прощупайте через сделанный ранее разрез и переместите его в заднем направлении вдоль дорсальной боковой поверхности почки.

Чтобы создать мешочек между капсулой почки и паренхимой почки, переместите люверсы в подготовленном 25-миллилитровом шприце Гамильтона к самому краю скошенного отверстия гибкой трубки. Затем вставьте скошенный край вверх в подкапсульный мешочек. Длинный край соприкасается с паренхимой почки.

Переместите трубку к самому заднему концу капсулы. Затем медленно перенесите люверсы из пробирки PE 50 в субкапсулярный мешочек, нажимая на поршень шприца. По мере того как люверсы наполняют мешочек, медленно возвращайте гибкую трубку наружу, чтобы освободить больше места.

После извлечения трубки из мешка проведите стеклянным зондом по внешней поверхности почки спереди назад, чтобы аккуратно упаковать ушки в проксимальный конец мешка. С помощью щипцов на согнутой руке приподнимите перитонеальную оболочку, прилегающую к отверстию, сделанному для почки. Затем с помощью аппликатора с ватным наконечником, пропитанным ватой, аккуратно протолкните почку обратно в брюшную полость.

Закройте мышь, наложив швы на стенку брюшины и зажимы для раны на дермальный слой. Верните мышь в клетку и мониторьте. Для выздоровления следует обеспечить кишечник мышей водой aceto meine.

C мышиные люверсы изолированы. С помощью методов, описанных в этом видео, и лечебная доза была пересажена аллогенным черным шести мышам C 57. Уровень глюкозы в крови натощак контролировали, начиная с первого дня после операции.

Отторжение наблюдается примерно на 17-й день у 20-граммовых мышей-реципиентов, которые получили 300 глазков от аллогенного донора. Выздоровление контролировалось у мышей, которые получили либо 150 глазков, либо 300 глазков от сингенных доноров. При этом отторжение не наблюдается, так как глазки получены от сингенных доноров.

Вводимая доза глазков измеряет первичную функцию глазков сразу после трансплантации. В то время как маргинальное выздоровление наблюдалось при 150 глазках, полное выздоровление наблюдалось при пересадке 300 глазков. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как выполнять критические шаги, необходимые для изоляции глазков мыши и пересадки этих глазков под субкапсулярное пространство почки.

С практикой вы разовьете способность быстро канюлировать общий желчный проток, что является самым сложным этапом этого протокола.