Визуализация личинок Сегментные Нервы у 3 ^Й Инстар Drosophila Подготовка личинок

Аксональный транспорт можно изучать путем визуализации сегментарных нервов личинки. Третья линька дрозофилы. Сначала проводят диссекцию личинки, обнажая ЦНС, не повреждая при этом оптические доли, вентральный ганглий и сегментарные нервы.

Второй этап процедуры заключается в фиксации лавы формальдегидом перед инкубацией с первичным антителом в течение ночи и со вторичным антителом в течение одного часа в темноте. Затем лаву помещают на предметное стекло для изучения дефектов аксонального транспорта. Локализацию и распределение белков можно исследовать с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Хотя этот метод позволяет получить представление об аксональном транспорте, его также можно применять к другим системам, таким как морфология синапсов и мышц. Как правило, лицам, впервые осваивающим этот метод, будет трудно, так как изначально сложно выполнить допустимую диссекцию, особенно сохранить целостность сегментарных нервов и мышц мозга. Для начала этой процедуры приготовьте 1× фиксирующий буфер для диссекции, 1× PBT и 5% раствор BSA.

Согласно таблице, представленной перед началом диссекции, подготовьте чистый набор пинцетов №5, чистый набор ножниц с прямыми лезвиями и иглы для проведения диссекции; используйте микроложечку для сбора личинок третьего instar определенного генотипа в чашку Петри. Затем промойте личинок в чашке Петри с деионизированной водой, чтобы удалить остатки пищи.

Затем поместите личинку на чашку Петри дорсальной стороной вверх. Закрепите личинку булавками в переднем и заднем концах. С помощью тонких ножниц нанесите каплю одноразового диссекционного буфера на закрепленную личинку.

Зажмите кутикулу на дорсальной средней линии вблизи заднего конца. С помощью ножниц разрежьте кутикулу от заднего конца к переднему. Нанесите каплю 1-кратного диссекционного буфера на вскрытую кутикулу.

С помощью булавки захватите один боковой край кутикулы примерно посередине личинки и зафиксируйте его булавкой. Затем зафиксируйте второй боковой край кутикулы; таким образом, с каждой боковой стороны используются по две булавки, как показано на схеме. Теперь осторожно удалите кишечник, жировые тела и трахеи, оставив только мозг с двумя оптическими долями и брюшными ганглиями.

После фиксации сегментарных нервов и их прикрепления проводят окрашивание антителами, при этом личинки остаются закрепленными в чашке-держателе. Инкубируйте препарированных личинок в 50 µL фиксатора в течение 30 минут. Заменяя фиксатор каждые 15 минут, после завершения фиксации промойте личинок в одном объеме PBT в течение 30 минут.

При замене буфера каждые 10 минут важно следить за тем, чтобы личинки всегда были полностью погружены в буфер. Приготовьте раствор первичных антител, разведя их до необходимой концентрации в 5% BSA растворе. Оптимальные концентрации различаются для разных антител.

Создайте влажную камеру, застелив пластиковую чашку салфеткой KimWipe, смоченной в воде. Повторите эту процедуру PBT раз.

Промойте подготовленным раствором первичных антител и инкубируйте во влажной камере при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи до следующего дня. Промойте препарированные личинки в 1-кратном PBT в течение 30 минут, заменяя буфер каждые 10 минут. Приготовьте раствор вторичных антител, разведя их до соответствующей концентрации в 5% растворе BSA.

Оберните влажную камеру фольгой, так как некоторые вторичные антитела чувствительны к свету. Инкубируйте личинок в растворе вторичных антител при 25 °C в течение одного часа. По завершении инкубации с вторичными антителами промойте личинок в 1× PBT в течение 30 минут, заменяя буфер каждые 10 минут, после чего перейдите к подготовке и визуализации препарированных личинок перед их размещением на предметном стекле.

Подготовьте предметное стекло, нанеся в центре две вертикальные линии лака для ногтей с промежутком, достаточным для размещения покровного стекла, как показано на диаграмме. Дайте лаку для ногтей полностью высохнуть. Поместите каплю буфера для монтажа в пространство между вертикальными линиями лака на предметном стекле, как показано на данном изображении.

Предстекло теперь готово к закреплению. Извлеките личинок после того, как последняя пройдет PBT. Промойте и осторожно удалите боковые булавки из личинки.

Будьте осторожны, чтобы не повредить кутикулу. Извлеките две оставшиеся булавки, захватите личинку пинцетом и поместите ее на подготовленный предметное стекло. Убедитесь, что личинка не перевернута и ориентирована вентральной стороной вверх.

Аккуратно накройте образец покровным стеклом и загерметизируйте края лаком для ногтей, как показано на рисунке. Теперь личинки готовы к визуализации с помощью флуоресцентного микроскопа. На данном репрезентативном изображении представлена личинка дикого типа, окрашенная антителами к белку синаптических везикул — цистин-стринг-белку.

Сегментарные нервы мух дикого типа окрашены равномерно. Здесь представлен мутант по моторному белку lava, окрашенный антителами к CSP. В сегментарных нервах наблюдаются массивные скопления, которые ярко окрашиваются на CSP.

При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости сохранения сегментарных нервов, прикрепленных к мозгу, и целостности мышц. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать технику диссекции. Выполните иммуногистохимическое окрашивание третьего сегмента и начните исследование сегментарных нервов личинок для изучения аксонального транспорта с помощью флуоресцентного микроскопа.