Индукция и оценка класса Рекомбинация коммутатор в Очищенная мышиные клетки B

В ходе гуморального иммунного ответа B-клетки, активированные антигеном, пролиферируют и секретируют антитела по мере развития ответа. Для оценки пролиферации и переключения классов антител исходный изотип IgM заменяется на более разнообразные изотипы IgG, IgA или IgE. B-клетки селезенки выделяют in vitro из экспериментальной мыши с помощью метода магнитной сепарации клеток.

Клетки окрашивают флуоресцентным красителем CFSE для мониторинга пролиферации, которая стимулируется воздействием бактериального L-P-S. Стимуляция L-P-S также индуцирует переключение классов на изотип IgG3, что, наряду с пролиферацией, можно отслеживать с помощью проточной цитометрии. Сегодня я продемонстрирую вам метод выделения и активации чистых B-клеток селезенки. Этот метод может быть использован для изучения рекомбинации переключения классов и пролиферации in vitro, а также для поиска ответов на ключевые вопросы в области иммунитета B-клеток, включая функции и регуляцию цитидиндезаминазы, индуцируемой активацией.

Начните с погружения эвтаназированной мыши в 70% ethanol. Возраст мыши должен составлять от восьми до 12 недель для обеспечения полного созревания иммунной системы. С помощью стерильных ножниц сделайте надрез кожи и мышц в области левого подреберья живота. Используйте ножницы или пинцет, чтобы извлечь селезенку из прилегающих тканей.

Затем разрежьте селезенку в PBS на три крупных фрагмента. После этого, используя резиновый наконечник поршня шприца объемом 1 мл, аккуратно протрите селезенку через клеточный фильтр с размером пор 70 мкм в PBS. При этом следует использовать давящие, а не растирающие движения.

Поскольку гомогенизация может привести к разрыву крупных пролиферирующих клеток, центрифугируйте клетки при ускорении не более 350 G в течение пяти минут. Затем ресуспендируйте осадок в PBS.

Подсчитайте количество ресуспендированных клеток с помощью гемоцитометра в стерильной полистироловой пробирке объемом 5 мл. Приготовьте суспензию с концентрацией 1×10⁸ клеток на мл в PBS с 5% нормальной сывороткой крысы. В каждую пробирку можно добавить не более 2 мл.

Затем добавьте по 50 µL коктейля для негативной селекции и обогащения B-клеток мыши на каждый миллилитр клеток. После этого закройте пробирки крышками и поместите их в холодильник на 15 минут.

Добавьте 100 мкл коктейля для селекции биотина EP на каждый миллилитр клеток. Закройте пробирки крышками и поместите в холодильник на 15 минут. После инкубации с коктейлем для селекции биотина смешайте магнитные наночастицы EP и добавьте 100 мкл на каждый миллилитр клеток. Перемешайте смесь пипеткой, закройте пробирки и поместите их в холодильник на пять минут.

Доведите объем раствора до 2.5 milliliters с помощью PBS и поместите его в магнит сепаратор cept на пять минут. Переверните магнит вместе с пробиркой и быстро перелейте содержимое в новую полистирольную пробирку. Не встряхивайте пробирку, так как негативно селектированные клетки будут магнитно привязаны к стенкам пробирки. Чтобы дополнительно повысить чистоту клеточной суспензии, поместите новую пробирку с клетками в магнит на пять минут, затем снова перелейте содержимое в новую пробирку.

Этот этап может снизить общий выход клеток. Чистоту B-клеток можно оценить с помощью проточной цитометрии по B-клеточным поверхностным маркерам. После обогащения более 95% клеток должны быть B two 20 положительными.

Ресуспендируйте изолированные клетки в теплом PBS с добавлением 0,1% BSA до конечной концентрации 1 миллион клеток на миллилитр, используя стоковый раствор красителя CFSE с концентрацией 5 мМ, разведенный в стерильном диметилсульфоксиде. Добавьте два микролитра на каждый миллилитр клеточной суспензии в пробирке. CFSE используется для мониторинга деления стимулированных клеток.

Процесс, имеющий решающее значение для переключения изотипа. Для окрашивания первичных B-клеток оптимальна конечная концентрация 10 micromolar. Инкубируют при 37 degrees Celsius в течение 10 минут в темноте.

Обратите внимание, что CFSE чувствителен к свету, поэтому по возможности его следует хранить в темноте. После инкубации остановите действие красителя, добавив к клеткам равный объем сыворотки теленка и инкубируя смесь на льду. Чтобы промыть клетки в течение пяти минут, долейте в пробирки культуральную среду в объеме, как минимум в пять раз превышающем исходный; это необходимо для нейтрализации вязкости сыворотки теленка и обеспечения образования клеточного осадка, затем центрифугируйте при 350 G. Промойте клетки в культуральной среде еще дважды, после чего они будут готовы к стимуляции.

Приготовьте среду для культуры B-клеток in vitro, добавив в RPMI 1640 10% fetal bovine serum и 50 micromolar Beta-mercaptoethanol. Затем приготовьте стимулирующую среду, добавив LPS до конечной концентрации 50 micrograms per milliliter. Расположите аликвоты стимулирующей среды по 125 microliters в каждую лунку 96-луночного плоского планшета для культивирования тканей.

Подготовьте окрашенные CFS E B-клетки в культуральной среде без LPS до конечной концентрации 3,2 × 10⁶ клеток на мл. Добавьте 125 мкл клеточной суспензии в лунки, содержащие среду для стимуляции, и перемешайте, осторожно пипетируя. Теперь в каждой лунке находится 400 000 клеток при конечной концентрации LPS 25 мкг/мл.

Это обеспечивает оптимальный уровень пролиферации клеток и переключения классов. Хотя эти значения могут быть изменены по необходимости, инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 72–96 часов. Через 48 часов под микроскопом станут отчетливо видны скопления крупных пролиферирующих B-клеток, что позволит оценить переключение классов.

Извлеките клетки из инкубатора и промойте их дважды в одном миллилитре буфера для окрашивания, чтобы предотвратить неспецифическое связывание антител. Осадите клетки, центрифугировав их при 350 G. Затем ресуспендируйте клетки в 100 микролитрах буфера для окрашивания с 5% нормальной сыворотки мыши и одним микрограммом FC-блока на миллион клеток и инкубируйте в течение 15 минут на льду без промывки. Добавьте флуоресцентно меченное антитело anti-US IgG три в концентрации один микрограмм на миллион клеток, инкубируйте в течение 30 минут на льду, промойте клетки дважды и ресуспендируйте их в двух-трехстах микролитрах буфера для окрашивания.

Теперь клетки готовы к анализу методом проточной цитометрии. Оптимальное возбуждение CFSE происходит при 492 нанометрах с помощью аргонового ионного лазера, а эмиссия — при 517 нанометрах. Спектры возбуждения и эмиссии антитела IgG 3 зависят от конъюгированного с ним флуоресцентного красителя.

После магнитного обогащения клеточная суспензия должна выглядеть как гомогенная популяция неразличимых мелких округлых клеток. После 48–72 часов стимуляции станут отчетливо видны изолированные кластеры увеличенных пролиферирующих клеток. Значительная часть непролиферирующих клеток будет выглядеть мелкой и зернистой по мере того, как в них будет происходить апоптоз.

Обычно CSR обнаруживается на максимальном уровне через 72–96 часов после стимуляции, прежде чем большинство клеток начнут погибать. К этому этапу клетки должны пройти через несколько циклов деления, при этом переключенные клетки появляются в более поздних популяциях дочерних клеток. После выполнения данных протоколов можно использовать другие методы, такие как РНК-интерференция или нокдаун генов с помощью ИИ, для изучения влияния любого гена на функцию ID и процесс рекомбинации переключения классов.