Визуализация Эмбриональные нервной системы в целом монтажа Drosophila Эмбрионы

Общая цель данной процедуры — подготовить эмбрионы oph и melanogaster для визуализации нервной системы целых образцов. Это достигается путем первоначального сбора эмбрионов интересующей линии мух. Вторым этапом процедуры является удаление хориона с помощью отбеливателя.

Третьим этапом процедуры является нанесение гептана и метанола для удаления вилин-мембраны. Заключительным этапом процедуры является нанесение антител на эмбрионы. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие структуру нервной системы эмбриона drosophila с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, о том, какую роль могут играть мутации в развивающейся нервной системе. Как правило, специалисты, впервые использующие этот метод, могут столкнуться с трудностями, так как существует риск случайного вымывания эмбрионов из флакона. Начните выполнение протокола с приготовления необходимых реагентов, включая P-E-M-F-A, буфер PBC с 5% BSA и 0,01% азидом натрия, а также формальдегидный фиксатор.

Подготовьте клетку для интересующего штамма дрозофил, оглушив мух углекислым газом, а затем перенеся не менее 100 мух в пластиковую бутыль с адаптером, в котором находится питательная среда из агара с яблочным соком. Поместите клетку с мухами в темное место при комнатной температуре на 72 часа. Меняйте питательные среды из агара с яблочным соком каждые 8–12 часов, чтобы мухи акклиматизировались в клетке и не задерживали откладку яиц до начала эксперимента.

По истечении 72-часового периода акклиматизации соберите эмбрионы через 12 часов после последней смены чашки с яблочным агаром. Извлеките чашку с яблочным агаром из клетки для яйцекладки и замените ее, используя физиологический раствор. Промойте чашку с яблочным агаром.

Соберите эмбрионы с помощью мелкого сита. Используйте чистую кисть для рисования, чтобы отделить любые эмбрионы, которые остались прилипшими к планшету. Промойте эмбрионы в сите физиологическим раствором, чтобы удалить излишки дрожжей; затем с помощью шпателя осторожно подберите эмбрионы и перенесите их в небольшой стеклянный флакон.

Добавьте около одного миллилитра физиологического раствора. Затем закройте флакон крышкой и инкубируйте в течение пяти минут для промывки эмбрионов. После этого следует сбор эмбрионов.

Приготовьте фиксирующий раствор гептана, смешав 50% гептана и 50% фиксатора. Раствор расслоится: гептан окажется сверху, а фиксатор — снизу. Через пять минут с помощью пастеризованной пипетки удалите избыток физиологического раствора из стеклянного флакона с эмбрионами.

Промойте эмбрионы деионизированной водой, добавив примерно 1 мл деионизированной воды в стеклянный флакон с эмбрионами. Оставьте эмбрионы на одну минуту, после чего удалите воду и добавьте 50% раствор гипохлорита натрия. Несколько раз встряхните флакон вручную, затем инкубируйте в течение трех минут для обработки поверхности эмбрионов.

Очищенные эмбрионы осядут на дно флакона. Эмбриональные CORs будут плавать на поверхности. Удалите отбеливатель и CORs после трехминутной инкубации.

После окрашивания тщательно промойте эмбрионы деионизированной водой, добавив примерно 1 мл деионизированной воды в стеклянный флакон с эмбрионами. Оставьте эмбрионы на одну минуту, затем удалите воду; остатки COR всплывут, и их следует удалить. Добавьте к эмбрионам фиксирующий раствор гептана и инкубируйте их в течение 30 минут при осторожном встряхивании для фиксации.

С помощью паста-пипетки удалите фиксатор (нижний слой), оставив в пробирке гептан. Затем добавьте на дно пробирки метанол взамен фиксатора, закройте пробирку крышкой и энергично встряхните ее вручную, чтобы удалить вителлинную мембрану. После этого этапа эмбрионы осядут на дно пробирки.

С помощью пастельной пипетки удалите метанол и остатки жидкости из флакона, оставив деионизированные эмбрионы. Затем пять раз промойте эмбрионы метанолом, удаляя метанол пастельной пипеткой после каждого промывания. При каждом промывании инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут.

Поместите эмбрионы в смесь 50% раствора PBT и 50% метанола на пять минут для их регидратации. Затем продолжите процесс регидратации, перенеся их в 100% раствор PBT на пять минут. После этого проведите блокировку эмбрионов, инкубируя их в 5% растворе BSA с 0,01% азидом натрия в течение одного часа при температуре четырех градусов Цельсия.

Затем подготовьте первичные антитела для окрашивания эмбрионов, разводя их до соответствующей концентрации в 5% BSA с раствором 0,01% Sodium azide. В данной работе используются антитела к везикулярному цистеиновому белку (vesicular cysteine string protein) и анти-HRP антитела. Anti HRP распознает специфический нейрональный углеводный фрагмент, присутствующий в поверхностных гликопротеинах, что позволяет маркировать все нейроны.

Инкубируйте эмбрионы в растворе первичных антител в течение ночи при температуре 4 °C. Промойте эмбрионы PBT 10 раз в течение одного часа. Добавьте примерно 1 мл PBT в стеклянный флакон с эмбрионами и выдержите их в течение шести минут, после чего удалите PBT.

Повторите этот процесс нанесения PBT, инкубации и удаления PBT 10 раз. Приготовьте раствор вторичных антител в темноте, так как они чувствительны к свету, разведя их до соответствующей концентрации. Мы используем вторичные антитела Alexa в разведении 1:200.

Инкубируйте эмбрионы в течение двух часов при температуре 4 °C в растворе вторичных антител. Оберните стеклянный флакон с эмбрионами и раствором вторичных антител алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света. Промойте эмбрионы PBT 10 раз в течение одного часа.

Добавьте среду для заключения Vector Shield к эмбрионам и инкубируйте их в течение ночи при температуре 4 °C для фиксации. С помощью пастельной пипетки соберите эмбрионы вместе с небольшим количеством среды. Нанесите эмбрионы и среду на предметное стекло.

Накройте эмбрионы покровным стеклом и загерметизируйте его с помощью лака для ногтей. Визуализируйте эмбрионы с помощью флуоресцентного микроскопа. На данном этапе представлена ЦНС эмбриона на 16–17 стадиях развития.

Белок цистиновых струн показан красным цветом. HRP-нейроны показаны зеленым цветом. Обратите внимание на отчетливое окрашивание комиссуры на этом репрезентативном изображении.

Эмбриональная ПНС представлена на 16–17 стадиях. Снова белок цистиновой нити показан красным цветом, а нейроны — зеленым. Обратите внимание на повторяющиеся структуры периферических нейронов.

При выполнении данной процедуры важно осторожно обращаться с эмбрионами, чтобы случайно не извлечь их из флакона. После просмотра этого видео у вас должно сложиться четкое представление о том, как подготавливать эмбрионы oph fla для визуализации нервной системы методом целого препарата.