Визуализация Эмбриональные нервной системы в целом монтажа Drosophila Эмбрионы

Общая цель данной процедуры — подготовка эмбрионов oph и melanogaster для визуализации нервной системы методом целого препарата. Сначала собирают эмбрионы интересующего штамма мух. Вторым этапом процедуры является удаление хориона с помощью отбеливателя.

Третьим этапом процедуры является нанесение гептана и метанола для удаления вителлиновой мембраны. Заключительным этапом процедуры является применение антител к эмбрионам. В итоге можно получить результаты, демонстрирующие структуру нервной системы эмбриона drosophila с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, например, о том, какую роль могут играть мутации в развивающейся нервной системе. Как правило, новичкам в этом методе бывает трудно, так как они могут случайно выпустить эмбрионы из флакона. Начните выполнение данного протокола с подготовки необходимых реагентов, включая P-E-M-F-A, буфер PBC 5% BSA с 0,01% раствором азида натрия и фиксирующий формальдегид.

Подготовьте клетку для интересующего штамма дрозофил, оглушив мух углекислым газом, после чего перенесите не менее 100 мух в пластиковый флакон с адаптером и питательной средой из агара с яблочным соком. Поместите клетку с мухами в темное место при комнатной температуре на 72 часа. Меняйте чашки с агаром с яблочным соком каждые 8–12 часов, чтобы мухи адаптировались к клетке и не удерживали яйца до начала эксперимента.

По истечении 72-часового периода акклиматизации соберите эмбрионы через 12 часов после последней замены чашки с яблочно-агаровой средой. Извлеките чашку с яблочно-агаровой средой из клетки для откладки яиц и замените её, используя физиологический раствор. Промойте чашку с яблочно-агаровой средой.

Соберите эмбрионы с помощью мелкого сита. Используйте чистую кисть для рисования, чтобы удалить все эмбрионы, оставшиеся на планшете. Промойте эмбрионы в сите физиологическим раствором, чтобы удалить остатки дрожжей; затем с помощью шпателя аккуратно соберите эмбрионы и перенесите их в небольшой стеклянный флакон.

Добавьте около одного миллилитра физиологического раствора. Затем закройте пробирку крышкой и инкубируйте в течение пяти минут для промывки эмбрионов. После этого приступайте к сбору эмбрионов.

Приготовьте фиксирующий раствор на основе гептана, смешав 50% гептана и 50% фиксатора. Раствор расслоится: гептан окажется в верхнем слое, а фиксатор — в нижнем. По истечении пяти минут с помощью пастерновской пипетки удалите избыток физиологического раствора из стеклянного флакона с эмбрионами.

Промойте эмбрионы деионизированной водой, добавив примерно один миллилитр деионизированной воды в стеклянную пробирку с эмбрионами. Выждите одну минуту, после чего удалите воду и добавьте 50% раствор гипохлорита натрия (отбеливателя). Несколько раз осторожно встряхните пробирку вручную, затем инкубируйте в течение трех минут для обработки поверхности эмбрионов.

Очищенные эмбрионы осядут на дно флакона. Эмбриомальные COR будут плавать на поверхности. Удалите отбеливатель и COR после трехминутной инкубации.

После окрашивания тщательно промойте эмбрионы деионизированной водой, добавив примерно 1 мл деионизированной воды в стеклянный флакон с эмбрионами. Оставьте эмбрионы на одну минуту, затем удалите воду; оставшиеся CORs всплывут, и их следует удалить. Добавьте к эмбрионам фиксирующий раствор гептана и инкубируйте их в течение 30 минут при осторожном встряхивании для фиксации.

С помощью паста-пипетки удалите фиксатор, который представляет собой нижний слой, оставив гептан в пробирке. Затем добавьте метанол обратно на дно пробирки вместо фиксатора, закройте пробирку крышкой и энергично встряхните ее вручную, чтобы удалить вителлиновую оболочку. После этого этапа обработанные эмбрионы осядут на дно пробирки.

С помощью пастерной пипетки удалите метанол и гексаны из флакона, оставив дегидратированные эмбрионы. Затем пять раз промойте эмбрионы метанолом, удаляя метанол пастерной пипеткой после каждого промывания. При каждом промывании инкубируйте эмбрионы в течение пяти минут.

Поместите эмбрионы в смесь 50% раствора PBT и 50% метанола на пять минут для их регидратации. Затем продолжите процесс регидратации, перенеся их в 100% раствор PBT на пять минут. Далее проведите блокировку эмбрионов, инкубируя их в 5% растворе BSA с 0,01% азидом натрия в течение одного часа при температуре четырех градусов Цельсия.

Затем подготовьте первичные антитела для окрашивания эмбрионов, разбавив их до соответствующей концентрации в растворе 5% BSA с 0,01% азида натрия. В данной работе используются антитела против везикулярного цистеин-содержащего белка и антитела anti-HRP. Anti-HRP распознает нейрон-специфический углеводный фрагмент, присутствующий в поверхностных гликопротеинах, что позволяет маркировать все нейроны.

Инкубируйте эмбрионы в растворе первичных антител в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Промойте эмбрионы PBT 10 раз в течение одного часа. Добавляйте примерно один миллилитр PBT в стеклянный флакон с эмбрионами, выдерживайте их в растворе шесть минут, после чего удалите PBT.

Повторите этот процесс нанесения PBT, инкубации и удаления PBT 10 раз. Приготовьте раствор вторичных антител в темноте, так как они чувствительны к свету, разбавив их до соответствующей концентрации. Мы используем вторичные антитела Alexa в концентрации 1:200.

Инкубируйте эмбрионы в течение двух часов при температуре 4 °C в растворе вторичных антител. Оберните стеклянный флакон с эмбрионами и раствором вторичных антител алюминиевой фольгой во избежание воздействия света. Промойте эмбрионы 10 раз с использованием PBT в течение одного часа.

Добавьте среду для заключения Vector Shield к эмбрионам и инкубируйте их в течение ночи при температуре four degrees Celsius для фиксации. С помощью пастельной пипетки перенесите эмбрионы вместе с небольшим количеством среды для заключения. Нанесите эмбрионы и среду на предметное стекло.

Накройте эмбрионы покровным стеклом и загерметизируйте края стекла с помощью лака для ногтей. Визуализируйте эмбрионы с помощью флуоресцентного микроскопа. Центральная нервная система (ЦНС) эмбриона представлена на 16–17 стадиях развития.

Белок цистиновой цепочки показан красным цветом. HRP-нейроны показаны зеленым цветом. Обратите внимание на отчетливое окрашивание комиссуры на этом репрезентативном изображении.

На стадиях 16–17 показана эмбриональная ПНС. Белок цистинкового шнурка снова обозначен красным цветом, а нейроны — зеленым. Обратите внимание на повторяющиеся структуры периферических нейронов.

При выполнении данной процедуры важно проявлять осторожность при работе с эмбрионами, чтобы случайно не извлечь их из флакона. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как подготавливать эмбрионы oph fla для визуализации нервной системы в целом препарате.