Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Общая цель следующего эксперимента заключается в создании гибридов РНК-ДНК на хромосомном уровне в живых клетках дрожжей путем трансформации клеток дрожжей олигонуклеотидами, содержащими РНК. Это достигается путем введения одноцепочечного олигонуклеотида, содержащего РНК, в делящиеся клетки дрожжей. Затем олигонуклеотид отжигается с комплементарным участком мутировавшего гена-маркера, расположенного на хромосоме дрожжей, с образованием гибрида РНК-ДНК; вторым этапом клетки, трансформированные олигонуклеотидом, содержащим РНК, высевают на селективные среды.

Это позволяет выращивать клетки, в которых РНК-фрагмент олигонуклеотида служит матрицей для коррекции мутировавшего ген-маркера. Затем подсчитывают количество дрожжевых колоний, растущих на селективных средах, чтобы определить частоту коррекции гена с помощью РНК-содержащего олигонуклеотида; полученные результаты свидетельствуют о переносе генетической информации из РНК-участка олигонуклеотида в мутировавший ген-маркер генома дрожжей. Это подтверждается анализом рестрикционного расщепления, секвенированием и анализом щелочной лабильности.

Здравствуйте, я основатель HIN, лаборатории доктора Франчески на факультете биологии Технологического института Джорджии. Сегодня мы продемонстрируем вам процедуру создания РНК-ДНК гибридов на хромосомном уровне в живых клетках дрожжей. Мы используем этот метод в нашей лаборатории, чтобы изучить, как клетки переносят присутствие РНК, встроенной в геномную ДНК, и определить, какие факторы влияют на стабильность РНК-ДНК гибридов in vivo.

Итак, приступим. Перед началом данной процедуры протрите все материалы, которые будут использоваться в эксперименте, включая пробирки для олигонуклеотидов, пипетки, штативы для вортекса, рабочую область и перчатки исследователя, раствором для деконтаминации РНК. Чтобы исключить возможное загрязнение РНК, на протяжении всей процедуры используйте воду, свободную от РНК, химические реагенты, пробирки и наконечники для пипеток, сертифицированные как свободные от РНК.

Получите олигонуклеотид, содержащий РНК, для переноса генетической информации в геномную ДНК клеток дрожжей. Используемый здесь штамм дрожжей содержит мутантный ген trip five с делецией двух оснований и одной нонсенс-мутацией. Такой штамм дрожжей является триптофан-ауксотрофным мутантом и не образует колоний на средах без триптофана.

Олигонуклеотид, содержащий РНК, представляет собой 65-мер с двухнуклеотидной ДНК-вставкой, предназначенной для коррекции делеционной мутации. Кроме того, олигонуклеотид содержит один рибонуклеотид для коррекции нонсенс-мутации аллеля trip five. После получения приготовьте стоковый раствор олигонуклеотида, содержащего РНК, с концентрацией 250 µM, как описано в письменном протоколе. За 16 часов до трансформации олигонуклеотидом, содержащим РНК, проведите инокуляцию.

Добавьте пять миллилитров жидкой питательной среды YPD (дроксоза-пептон-дрожжевой экстракт) к клеткам дрожжей мутанта trip five и культивируйте их при 30 °C в течение ночи. После ночной инкубации перенесите 1,5 миллилитров ночной культуры в 50 миллилитров жидкой среды YPD. Инкубируйте клетки в шейкере при 30 °C и скорости 225 об/мин в течение четырех часов непосредственно перед размораживанием для трансформации.

Олигонуклеотиды, содержащие РНК, и соответствующие олигонуклеотиды, состоящие только из ДНК, храните на льду. Олигонуклеотиды, состоящие только из ДНК, используются в качестве положительного контроля. Разведите олигонуклеотиды до концентрации 50 micromolar, используя воду, свободную от РНК, в пробирках, свободных от РНК.

Подготовьте по 70 µL каждого олигонуклеотида, чтобы обеспечить достаточное количество образца для трех трансформаций одного моля с небольшим избытком. Денатурируйте олигонуклеотиды, содержащие РНК, и олигонуклеотиды, состоящие только из ДНК, на нагревательном блоке при 100 °C в течение двух минут для устранения вторичных структур. Сразу после денатурации поместите пробирки на лед и держите их там до начала трансформации. Непосредственно перед трансформацией приготовьте раствор один и раствор два в пробирках, свободных от РНК. Перенесите клеточную культуру в пробирку объемом 50 mL, свободную от РНК, и центрифугируйте при 3000 об/мин (что соответствует 1 562 ×g) в течение двух минут.

Удалите супернатант и промойте клетки 50 миллилитрами воды, свободной от РНКаз. Снова центрифугируйте клетки при 3000 об/мин в течение двух минут. Повторите этот процесс пять раз, чтобы удалить культуральную среду и любые РНКазы, которые могли остаться после финального центрифугирования.

Удалите супернатант и снова суспендируйте клетки в пяти миллилитрах раствора. Один. Центрифугируйте образец при 3000 rotations per minute в течение двух минут, удалите супернатант и добавьте к клеткам 250 µL раствора один. Такого количества клеток достаточно для семи-восьми трансформаций.

Перенесите по 50 µL клеточной суспензии в каждую из семи микроцентрифужных пробирок, не содержащих РНК. Затем добавьте 20 µL 50 мкМ олигонуклеотида, содержащего РНК, в три пробирки, 20 µL 50 мкМ олигонуклеотида, содержащего только ДНК, в три пробирки и 20 µL стерильной воды без олигонуклеотида в одну пробирку для отрицательного контроля.

Затем добавьте по 300 µL раствора два в каждую из семи реакций трансформации. Энергично перемешайте образцы на вортексе для гомогенизации компонентов. Инкубируйте смеси для трансформации при 30 °C в течение 30 минут на шейкере.

Подвергните образцы тепловому шоку при 42 °C в течение 15 минут. Затем центрифугируйте клетки при 5 000 об/мин, что соответствует 2 236 ×g, в течение четырех минут. Удалите супернатант и ресуспендируйте клетки в 100 µL стерильной воды для каждой из трех пробирок.

Возьмите аликвоту данной клеточной суспензии и разведите каждую аликвоту стерильной водой в 100 000 раз. Добавьте примерно по 15 стерильных стеклянных шариков на каждую чашку и высейте по 100 µL клеток в 100 000-кратном разведении на три чашки с YPD-средой. Высейте по 100 µL ресуспендированных клеток из каждой реакции трансформации на одну чашку Петри с синтетической полноценной твердой средой без триптофана и равномерно встряхните чашки.

Затем удалите гранулы. Инкубируйте клетки на чашках с YPD при 30 °C в течение двух дней, а клетки, высеянные на синтетическую полноценную твердую среду без триптофана, инкубируйте при 30 °C от четырех до пяти дней. Подсчитайте и сравните количество колоний, выросших на селективной среде и на среде YPD, чтобы рассчитать частоту коррекции гена для олигонуклеотида с РНК, только ДНК-олигонуклеотида и контрольного образца без олигонуклеотида.

При отсутствии добавления олигонуклеотидов в клетки на селективной среде рост колоний не ожидается; высейте несколько случайно выбранных трансформированных колоний на среду YPD для получения изолятов одиночных колоний. Инкубируйте клетки в течение двух дней при 30 °C для роста колоний. После инкубации выберите несколько одиночных колоний и сделайте мазки на YPD и на селективную среду.

После одного дня инкубации на синтетической полноценной твердой среде без триптофана наблюдается рост клеток, трансформированных олигонуклеотидами, в то время как контрольный штамм без олигонуклеотидов на селективной синтетической полноценной твердой среде без триптофана не растет. Далее, для начала проведения колоний-ПЦР, разработайте пару праймеров для амплификации области, на которую нацелен олигонуклеотид, содержащий РНК. Ресуспендируйте клетки, взятые из отдельных пятен, в 50 µL воды, содержащей одну единицу лиазы, инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего поместите их в термоблок при 100 °C на пять минут для лизиса клеток и высвобождения геномной ДНК в раствор.

Подготовьте ПЦР-реакции в ПЦР-пробирках, добавив в каждую подготовленную пробирку 10 µL клеточной суспензии, и проведите реакцию амплификации согласно письменному протоколу. Проведите электрофорез полученных образцов в 1% агарозном геле для визуализации ПЦР-продукта. Поскольку генетическая информация, перенесенная с помощью содержащего РНК олигонуклеотида в данном эксперименте, создает новый сайт рестрикции VAN 91 1 в целевом регионе генома дрожжей, правильность переноса информации можно подтвердить путем рестрикции ПЦР-продукта ферментом рестрикции van 91 1.

Подготовьте реакционную смесь для рестрикции, добавив 6 µL буфера для ПЦР с BSA, 0,5 µL фермента рестрикции и стерильную воду до общего объема 15 µL. Инкубируйте образцы в течение одного часа при 37 °C. Проведите электрофорез нерасщепленного образца вместе с расщепленными образцами в одном ряду 2% агарозного геля, чтобы наблюдать генетическую модификацию, перенесенную РНК-трактом РНК-содержащего олигонуклеотида.

Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР и подготовьте их к секвенированию ДНК. Направьте образцы на секвенирование с использованием тех же праймеров, которые применялись для амплификации продукта. В завершение проанализируйте результаты секвенирования ДНК с помощью программного обеспечения, позволяющего проводить выравнивание нескольких последовательностей по выбранной референсной последовательности, чтобы выполнить щелочную обработку олигонуклеотида, содержащего РНК, для каждой реакции при концентрации один моль олигонуклеотида, содержащего РНК, или только ДНК-олигонуклеотида в пробирке объемом 1.5 миллилитр.

Затем добавьте 4 µL 1 M гидроксида натрия для гидролиза или 4 µL воды для отрицательного контроля. Инкубируйте образцы на водяной бане при 65 °C в течение одного часа. Перенесите реакционную смесь на лед.

Нейтрализуйте реакцию гидролиза, добавив два микролитра 1,2 M соляной кислоты, четыре микролитра 1 M трис-гидрохлорида и четыре микролитра воды для отрицательного контроля. Добавьте шесть микролитров воды и четыре микролитра 1 M трис-гидрохлорида. Храните образцы на льду до проведения трансформации.

Как было описано выше, дрожжевые клетки, трансформированные без олигонуклеотидов, не образуют колоний на синтетической полноценной твердой среде без триптофана. Напротив, клетки, выращенные на синтетической полноценной твердой среде без триптофана после трансформации одной долей олигонуклеотида, содержащего РНК, теперь образуют колонии.

Колонии дрожжей также растут на синтетической полноценной твердой среде без триптофана после трансформации клеток одним наномолем только контрольного олигонуклеотида соответствующей ДНК; перенос генетической информации от олигонуклеотида, содержащего РНК, в хромосомную ДНК дрожжей подтверждается рестрикционным расщеплением продукта ПЦР с амплификацией целевого геномного региона ферментом VAN 91 1. Как показано, может быть виден продукт ПЦР локуса trip. Five, амплифицированный из геномной ДНК мутантного штамма trip. Five.

Также показан ПЦР-продукт, амплифицированный из геномной ДНК колонии trip plus, которая была мишенью для олигонуклеотида, содержащего только ДНК. В гель также были внесены ПЦР-продукты, амплифицированные из геномной ДНК колоний trip plus, которые были мишенью для олигонуклеотида, содержащего РНК. Результаты рестрикции тех же ПЦР-продуктов ферментом van 91 1 выявили амплифицированную ПЦР-полосу размером 278 base pair и полосы продуктов рестрикции van 91 1 размером 177 base pairs и 101 base pairs.

Секвенирование ДНК подтверждает коррекцию гена с помощью олигонуклеотида, содержащего РНК. Представлен электрофореграмма ДНК геномного участка, который был мишенью для олигонуклеотида, содержащего РНК. Основание g в последовательности ДНК происходит от RG в олигонуклеотиде, содержащем РНК go.

Также в рамку заключена вставка последовательностей CG-оснований в области trip five трансформантов trip plus, которые были подвергнуты таргетному воздействию только ДНК-олигонуклеотидом и РНК-содержащим олигонуклеотидом; эти последовательности соответствуют консенсусной последовательности и сопоставлены с последовательностями мутантных клеток trip five до воздействия олигонуклеотидами. Репарирующий РНК-содержащий олигонуклеотид в нижней части содержит вставку из двух оснований ДНК и замену одного основания РНК.

Области, выделенные синими рамками с желтой заливкой, показывают, что олигонуклеотид, содержащий РНК, а также олигонуклеотид, состоящий только из ДНК, точно исправили делеционную и нонсенс-мутации во всех протестированных образцах; пунктирные линии отмечают положение последовательности олигонуклеотида, содержащего РНК. Щелочная обработка предотвращает коррекцию гена олигонуклеотидом, содержащим РНК; представлена частота трансформации при использовании олигонуклеотида, содержащего РНК, и олигонуклеотида, состоящего только из ДНК. Планки погрешностей представляют стандартную ошибку среднего для трех независимых трансформаций для каждого олигонуклеотида.

Олигонуклеотид, состоящий только из ДНК, демонстрирует схожую частоту трансформации как без обработки гидроксидом натрия, так и с ней. Напротив, частота трансформации олигонуклеотида, содержащего РНК, падает до нуля после обработки гидроксидом натрия. Таким образом, препарат олигонуклеотида, содержащего РНК, не загрязнен олигонуклеотидом, состоящим только из ДНК.

Таким образом, наблюдаемая частота трансформации специфична для олигонуклеотидов, содержащих РНК. Мы только что продемонстрировали вам способ формирования гибрида РНК-ДНК на хромосомном уровне и рассмотрели перенос генетической информации от РНК к геномной ДНК в клетках дрожжей. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости использования высококачественных олигонуклеотидов, содержащих РНК, и соблюдения условий отсутствия РНКаз.

На этом все. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.