Генерация РНК / ДНК гибридов в геномной ДНК с помощью преобразования с помощью РНК-содержащих олигонуклеотидов

Общая цель данного эксперимента заключается в получении R-N-A-D-N-A гибридов на хромосомном уровне в живых дрожжевых клетках путем трансформации дрожжевых клеток с помощью РНК, содержащих олигонухозы. Это достигается за счет введения в клетки делящихся дрожжей одной нити, РНК, содержащей олиго. Затем олиго встает на колени с комплементарной областью мутировавшего маркерного гена, расположенного на дрожжевой хромосоме, образуя гибрид R-N-A-D-N-A в качестве второго шага клетки, трансформированные РНК, содержащими олиго, помещаются на селективную среду.

Это позволяет выращивать клетки, в которых РНК-часть олиго служит матрицей для коррекции мутировавшего маркерного гена. Далее получены колонии дрожжей, растущие на селективных средах, учитываемых с целью выяснения частоты коррекции гена РНК-содержащими олиго, получены результаты, выявляющие перенос генетической информации из РНК-тракта олиго на мутировавший ген-маркер в геноме дрожжей. Это видно из анализа рестрикции, анализа пищеварения, последовательного анализа и анализа щелочной способности.

Здравствуйте, я основатель HIN лаборатории доктора Франчески в школе биологии Технологического института Джорджии. Сегодня мы покажем вам процедуру получения R-N-A-D-N-A гибридов на хромосомном уровне в живых дрожжевых клетках. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории, чтобы изучить, как присутствие РНК, встроенной в геномную ДНК, переносится клетками, и определить, какие факторы влияют на стабильность гибрида R-N-A-D-N-A IN VIVO.

Итак, приступим. Перед началом этой процедуры протрите все материалы, которые будут использоваться для эксперимента, включая олигопробирки, пипетки, вихревые штативы, экспериментальную зону и перчатки, которые носит исследователь, раствором для обеззараживания РНК. Чтобы удалить любое потенциальное загрязнение РНК, используйте воду, химические реагенты, пробирки и наконечники для пипеток на протяжении всей процедуры.

Получить РНК, содержащую олиго, для переноса генетической информации в геномную ДНК дрожжевых клеток. Используемый здесь штамм дрожжей содержит мутантный ген trip-five с двумя основаниями делеции и одной бессмысленной мутацией. Такой штамм дрожжей является триптофан-атрофическим мутантом и не образует колоний на средах без триптофана.

РНК, содержащая олиго, представляет собой 65 MER с двухкомпонентной вставкой ДНК, предназначенной для коррекции делеционной мутации. Кроме того, олиго имеет один рибонуклеотид для коррекции нонсенс-мутации трип-пяти аллелей после получения, получения РНК, содержащей олиго, до 250 микромолярного стокового раствора, как описано в письменном протоколе. За 16 часов до трансформации с инокулятом олигосодержащих РНК.

Пять миллилитров богатого пептида дрожжей декстрозы или жидкой среды YPD с пятью мутантными дрожжевыми клетками и выращивают клетки при температуре 30 градусов Цельсия за ночь. После ночной инкубации перелейте 1,5 миллилитров ночной культуры в 50 миллилитров жидкой среды YPD. Инкубируйте клетки в вибростенде с температурой 30 градусов Цельсия со скоростью 225 оборотов в минуту в течение четырех часов непосредственно перед трансформационным оттаиванием.

РНК, содержащая олигону и соответствующую ДНК, находится только на льду. В качестве положительного контроля используются только олигонуклептические ДНК. Разбавьте олигостеры до 50 микромоляров с помощью свободной от РНК воды в свободных от РНК пробирках.

Приготовьте 70 микролитров каждого олиго, чтобы дать образец достаточно для трех превращений одного моля с некоторым избытком денатурации, РНК, содержащей ДНК только олиго, на 100 градусах Цельсия нагревательном блоке в течение двух минут для устранения вторичных структур олигонотидов сразу после денатурации. Поместите пробирки на лед, удерживая их там до момента превращения Приготовьте раствор один и раствор два непосредственно перед превращением в свободные от РНК пробирки. Перенесите клеточную культуру в свободную пробирку с РНК объемом 50 миллилитров и вращайте со скоростью 3000 оборотов в минуту, что соответствует 1,562-кратной гравитации, в течение двух минут.

Удалите супинат и промойте клетки 50 миллилитрами свободной РНК воды. Снова вращайте ячейки со скоростью 3000 вращений в минуту в течение двух минут. Повторите этот процесс пять раз, чтобы избавиться от питательной среды и любых RN ais, которые могут присутствовать после последнего отжима.

Снимите супинат и снова суспендируйте клетки в пяти миллилитрах раствора. Один. Вращайте образец со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение двух минут, выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 250 микролитров раствора в ячейки. Этого количества клеток достаточно для семи-восьми превращений.

Аликвотировать 50 микролитров клеточной суспензии в каждую из семи свободных микроцентрифужных пробирок РНК. Далее добавьте 20 из 50 микромолярных РНК, содержащих олиго, в три пробирки. 20 микролитров из 50 микромолярной ДНК только олиго в трех пробирках и 20 микролитров стерильной воды без олиго для отрицательного контроля в одной пробирке.

Затем добавьте по 300 микролитров раствора по два для каждой из семи реакций превращения. Энергично перебейте образцы в вихрь, чтобы перемешать компоненты. После инкубации инкубируйте реакции трансформации при температуре 30 градусов Цельсия в течение 30 минут в шейкере.

Тепловой шок образцов при температуре 42 градуса Цельсия в течение 15 минут. Затем вращайте ячейки со скоростью 5000 вращений в минуту, что соответствует 2236-кратной гравитации в течение четырех минут. Удалите агент SUP и повторно суспендируйте клетки в 100 микролитрах стерильной воды для многих из трех пробирок.

Возьмите аликвоту этой клеточной суспензии и разведите каждую аликвоту стерильной водой в 100 000 раз. Добавьте около 15 стерильных стеклянных шариков на пластину и нанесите 100 микролитров из 100 000 раз разбавленных клеток на трех пластинах YPD. Выложите 100 микролитров ресуспендированных клеток от каждой реакции превращения на одну чашку Петри из синтетической полной твердой среды без триптофана и равномерно встряхните пластины.

Затем удалите бусины. Инкубируйте клетки на планшетах YPD при температуре 30 градусов Цельсия в течение двух дней и инкубируйте клетки, покрытые на синтетической полной твердой среде без триптофана при 30 градусах Цельсия, в течение четырех-пяти дней. Подсчитайте и сравните количество колоний, выращенных на селективной среде, а также на среде YPD, чтобы рассчитать частоту коррекции генов для РНК, содержащей олиго, для ДНК, только олиго, и для контроля без олиго.

В селективной среде не ожидается образования колоний, когда в клетки не добавляются олиго, они выделяют несколько случайно выбранных трансформированных колоний на среду YPD для получения одиночных изолятов колоний. Инкубируйте клетки в течение двух дней при температуре 30 градусов Цельсия для роста колонии. После инкубации выберите несколько одиночных колоний и сделайте патчи на YPD и на селективной среде.

Синтетическая полная твердая среда без триптофана после однодневной инкубации наблюдается для клеток, трансформированных с олиго, но не для контрольного штамма без олиго на селективной синтетической полной твердой среде без триптофана. Затем разработайте пару праймеров для амплификации области, на которую нацелена РНК, содержащая олиго, используя ПЦР с колониями, чтобы начать ПЦР с колониями. Повторно суспендируйте клетки, взятые из отдельных участков, в 50 микролитрах воды, содержащей одну единицу лиазы, инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут, после чего инкубируйте в тепловом блоке при температуре 100 градусов Цельсия в течение пяти минут, чтобы разбить клетки и выпустить геномную ДНК в раствор.

Приготовьте ПЦР-реакции в ПЦР-пробирках, добавив 10 микролитров клеточной суспензии в каждую установленную пробирку, и проведите реакцию амплификации, как описано в письменном протоколе. Прогоните полученные образцы на 1%-ном геле для наблюдения за продуктом ПЦР. Поскольку генетическая информация, передаваемая РНК, содержащей олиго, в этом эксперименте генерирует новый сайт рестрикции VAN 91 1 в области геномной мишени дрожжей, можно проверить правильность передачи информации путем расщепления продукта ПЦР с помощью фермента рестрикции van 91 1.

Настройте реакцию разложения таким образом, чтобы в нее входили шесть микролитров продукта ПЦР, буфер БСА, 0,5 микролитра фермента рестрикции и стерильная вода до 15 микролитров. Инкубируйте образцы в течение одного часа при температуре 37 градусов Цельсия. Запустите непереваренный образец вместе с расваренными образцами в одном ряду с 2%-ным гелем, чтобы наблюдать за генетической модификацией, переносимой РНК-трактом РНК-содержащей олиго.

Очистите продукты ПЦР с помощью набора для очистки ПЦР и подготовьте их к секвенированию ДНК. Отправьте образцы на секвенирование с теми же праймерами, которые использовались для амплификации продукта. Наконец, проанализируйте результаты секвенирования ДНК с помощью программного обеспечения, которое позволяет выравнивать несколько последовательностей с выбранной референсной последовательностью для выполнения щелочной обработки РНК-содержащего олиго для каждой реакции на одном моле РНК-содержащего олиго, или олиго, содержащем только ДНК, в 1,5-миллилитровой пробирке.

Затем добавьте четыре микролитра одного молярного гидроксида натрия для гидролиза или четыре микролитра воды для отрицательного контроля. Инкубируйте образцы при температуре 65 градусов Цельсия на водяной бане в течение одного часа после инкубации. Перенесите реакцию на лед.

Нейтрализуйте реакцию гидролиза двумя микролитрами 1,2 молярной соляной кислоты, четырьмя микролитрами одного моляра трис гидрохлорида и четырьмя микролитрами воды для отрицательного контроля. Добавьте шесть микролитров воды и четыре микролитра одного моляра трис гидрохлорида. Держите образцы на льду до тех пор, пока не произойдет преобразование, которое можно выполнить.

Как только что было описано, дрожжевые клетки, трансформированные без олиго, не образуют колоний на синтетической полной твердой среде без триптофанового веера. И наоборот, клетки, выращенные на синтетической полной твердой среде без тритофана, после того, как клетки трансформируются одним оледом РНК-содержащего олиго. Теперь покажите колонии.

Колонии дрожжей также растут на синтетической полной твердой среде без тритофана, после трансформации клеток с одним наномолем соответствующей ДНК контролируют только олиго, обнаружение переноса генетической информации от РНК, содержащей олиго, к хромосомной ДНК дрожжей очевидно с помощью VAN 91 1 рестрикционного расщепления продукта ПЦР, амплифицирующего целевую область генома, как показано продуктом ПЦР трипа. Пять локусов амплифицированы из геномной ДНК поездки. Можно увидеть пять мутантных штаммов.

Также показан продукт ПЦР, амплифицированный из геномной ДНК, полученной из трип-плюс-колонии, на которую нацелена только олиго-ДНК. Продукты ПЦР, амплифицированные из геномной ДНК, полученной из трип-плюс-колоний, на которые нацелена РНК, содержащая олиго, также были запущены на геле. Результаты рестрикционного расщепления тех же продуктов ПЦР в фургоне 91 1 показали амплифицированную полосу ПЦР из 278 пар оснований и полосы продуктов распада с помощью фургона 91 1 из 177 пар оснований и 101 пары оснований.

Секвенирование ДНК показывает коррекцию генов РНК-содержащими олиго. Показана ДНК-электроферограмма участка генома, на который нацелена РНК-содержащая олиго. G в последовательности ДНК происходит от RG на РНК, содержащей олиго.

Также в коробку вставляются последовательности базисной КГ пяти областей трипа плюс трансформанты, на которые нацелены только олиго ДНК и РНК, содержащие олиго, совпадают в консенсусной последовательности и сравниваются с таковыми трипа. Пять мутантных клеток перед нацеливанием на олиго. Репарирующая РНК, содержащая олиго на дне, имеет вставку ДНК с двумя основаниями и замену РНК с одним основанием.

На участках, выделенных синим цветом с желтым оттенком, видно, что РНК, содержащая олиго, а также только олиго ДНК точно скорректировали делеционную мутацию и нонсенс-мутацию во всех исследуемых образцах, пунктирными линиями отмечено положение РНК-содержащей олигопоследовательности. Обработка щелочью препятствует коррекции генов РНК-содержащим олиго, показана частота трансформации РНК-содержащей олиго, и ДНК только олиго. Повторение аэробаров представляет собой стандартную ошибку среднего значения для трех независимых преобразований для каждого олиго.

Олиго, состоящий только из ДНК, демонстрирует аналогичную частоту трансформации без обработки гидроксидом натрия и с ней. И наоборот, частота превращения РНК-содержащей олиго падает до нуля после обработки гидроксидом натрия. Таким образом, препарат с РНК, содержащей олиго, не контаминирован ДНК, а только олиго.

Таким образом, наблюдаемая частота трансформации специфична для РНК-содержащей олиго. Мы только что показали вам, как сформировать гибрид R-N-A-D-N-A на хромосомном уровне, а также обзор переноса генетической информации от РНК к геномной ДНК в дрожжевых клетках. При выполнении этой процедуры важно помнить о отличном качестве РНК-содержащих олигонукосов и работать в условиях, свободных от РНК.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.