Выделение клапанные эндотелиальных клеток

В данном видеопротоколе продемонстрирован метод выделения резидентных интерстициальных и специфических для каждой стороны эндотелиальных клеток из клапана аорты. Створка клапана извлекается из сердца и помещается в холодный физиологический раствор. Эндотелиальный слой можно удалить с обеих сторон створки путем осторожного соскабливания ткани, погруженной в раствор коллагеназы, с помощью ватной палочки; для специфического выделения клеток с определенной стороны створка клапана закрепляется булавками на парафиновом основании таким образом, чтобы поверхность эндотелия была открыта.

Затем на створку клапана добавляют несколько капель охлажденной коллагеназы, после чего створки инкубируют от 5 до 10 минут. После инкубации с коллагеназой специфический эндотелиальный слой соответствующей стороны удаляют путем осторожного соскабливания ткани. Затем с помощью тампона собирают высвободившиеся эндотелиальные клетки, промывают их и высевают на чашки.

Затем оставшиеся створки подвергаются перевариванию в течение ночи для выделения интерстициальных клеток, которые затем собирают и промывают. Все выделенные клетки культивируют; они могут быть использованы для изучения их роли в восстановлении и ремоделировании сердечных клапанов в ответ на локальные механические и биологические сигналы. Здравствуйте, меня зовут Рассел Гоулд.

Я нахожусь в отделении биомедицинской инженерии Корнелльского университета, в лаборатории Бутчера. Сегодня я покажу вам, как изолировать эндотелиальные клетки клапанов сердца. Значимость данной методики заключается в понимании того, как резидентные эндотелиальные клетки постоянно восстанавливаются и перестраиваются в ответ на механические и биологические сигналы.

Итак, приступим. Для начала получите тушу свиньи на местной бойне и, соблюдая правила асептики, вырежьте корень аорты. Тщательно промойте корень аорты от крови.

Используя холодный стерильный DPBS, необходимо как можно скорее удалить все компоненты крови, чтобы ограничить гибель эндотелиальных клеток клапана (VEC) и бактериальное загрязнение. Использование антибиотиков и антимикотиков на данном этапе не рекомендуется, так как они потенциально вредны для клеток. Далее выполните изоляцию непосредственно из корня трех.

Створки каждого клапана. При выделении створок действуйте осторожно, так как любые ткани кольца приведут к загрязнению популяции клеток. Поместите выделенные створки в стерильную коническую пробирку объемом 15 milliliter, наполненную 12 milliliters холодного DPBS.

Несколько раз встряхните, чтобы удалить остатки тканей, и заново заполните сосуд свежим DPBS. После этого транспортируйте створки клапана обратно в лабораторию на льду. По прибытии в лабораторию поместите контейнер с тканью под стерильный ламинарный поток и приступите к выделению эндотелиального слоя; предварительно проавтоклавируйте в закрытом лотке для инструментов следующие принадлежности: зубчатый анатомический пинцет, ножницы для тканей и ватные тампоны.

Также подготовьте стерильный раствор коллагеназы, эндотелиальную среду и интерстициальную среду, как подробно описано в прилагаемом письменном протоколе. Наполните стерильную чашку диаметром 35 мм тремя миллилитрами холодного раствора коллагеназы на один клапан и перенесите все три створки из пробирки объемом 15 мл в чашку.

Инкубируйте ткань от 5 до 10 минут при 37 °C. Затем осторожно удалите эндотелиальный слой с обеих сторон створки, вращая сухим стерильным тампоном по поверхности. Направление вращения и сила прилагаемого сдвига имеют решающее значение для чистоты образца.

Вращение тампона осуществляется в направлении, противоположном линейному движению руки, удерживающей ватный тампон. Это создает контролируемый сдвиг, который отделяет эндотелиальные клетки от ткани. Прикладываемой силы должно быть достаточно, чтобы почувствовать сопротивление ткани, но не настолько много, чтобы пробить базальную мембрану; периодически промакивайте тампон в растворе коллагеназы, чтобы высвободить клетки из волокон наконечника.

После завершения соскабливания текстура эндотелиального слоя должна стать немного более гладкой, чем прежде. Соберите клетки, взвешенные в растворе коллагеназы, и перенесите их в новую стерильную пробирку объемом 15 мл. Сразу после удаления эндотелиальных клеток с листков поместите листки в пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл раствора коллагеназы, для изоляции интерстициальных клеток.

Центрифугируйте пробирки при 1000 RPM в течение пяти минут при комнатной температуре для осаждения изолированных клеток, затем аспирируйте супернатант. Добавьте три миллилитра эндотелиальной среды в пробирки объемом 15 миллилитров. Проведите центрифугирование второй раз аналогичным образом и аспирируйте среду.

Это второе центрифугирование помогает отфильтровать некоторые нежелательные примеси, такие как волокна от наконечников. Ресуспендируйте центрифугированные эндотелиальные клетки в 5 мл эндотелиальной среды и высейте клетки в Т-25 флакон, предварительно покрытый коллагеном. Используя по одному флакону на каждую пробирку центрифуги, дайте клеткам расти не менее двух-трех дней перед заменой эндотелиальной среды.

Это способствует восстановлению и делению клеток. Поскольку процесс изоляции довольно жесткий, а выход клеток может быть низким, крайне важно проводить пассирование клеток при достижении состояния, близкого к конфлюэнтности. Поскольку контактное торможение может привести к трансформации клеток, эндотелиальные клетки также можно изолировать с определенной стороны.

Для этого сначала подготовьте чашку Петри с введенным слоем парафина. Используйте стеклянные чашки Петри диаметром 60 мм с алюминиевой фольгой. Рассчитывайте по две стеклянные чашки на один листок.

Алюминиевая фольга помогает удалить парафин для повторного использования чашки Петри. Затем заполните чашки гранулами парафина примерно наполовину и накройте их перед автоклавированием. После завершения автоклавирования и расплавления парафина перенесите набор чашек на прохладную плоскую поверхность.

По мере остывания парафин затвердевает, образуя слой, который будет удерживать проколы иглой. Через 60 минут стерильную чашку можно использовать для иммобилизации ткани створки. Извлеките изолированные от клапана створки из пробирок объемом 15 мл и поместите их на парафиновый слой.

Расположите створки таким образом, чтобы желудочковая сторона была обращена вниз к парафиновой поверхности, а сторона с фиброзом оставалась открытой. Закрепите края створки булавками, чтобы обнажить эндотелиальный слой. Затем нанесите по несколько капель холодного коллагеназы на каждую эндотелиальную поверхность, обращенную вверх, и инкубируйте ткань в течение 5–10 минут при 37 °C.

По завершении инкубации аккуратно удалите слой эндотелия, как и прежде, прижимая сухой стерильный тампон к поверхности створки вращательными движениями. Время от времени окунайте тампон в раствор коллагеназы, чтобы освободить волокна наконечника от клеток. После завершения процедуры текстура эндотелиального слоя должна стать более гладкой, чем до этого.

Соберите клеточную суспензию и перенесите ее в новую стерильную пробирку объемом 15 миллилитров. Укажите на этикетке сторону локализации; листки из одного и того же клапана можно объединять. Промойте иммобилизованный клапан несколькими каплями холодного DPBS, чтобы удалить оставшиеся клетки или клеточный дебрис.

Перенесите створки в новую чашку для культивирования таким образом, чтобы теперь была открыта вентрикулярная сторона, и соберите эндотелиальные клетки, как показано ранее. После завершения соскоба эндотелиальных клеток с G-створки немедленно поместите створки в пробирку объемом 15 milliliter, содержащую 10 milliliters раствора коллагеназы. Промойте ресуспендированные клетки, суспендируйте их и культивируйте, как показано для неспецифического по стороне выделения эндотелиальных клеток.

Если выход клеток очень низкий, рассмотрите возможность перехода на колбу меньшего объема или использования многолуночного планшета. Поскольку адгезия способствует росту клеток, не забывайте проводить пассирование клеток при достижении почти полной конфлюэнтности. Поскольку контактное торможение может привести к трансформации клеток, начинайте выделение интерстициальных клеток во время центрифугирования эндотелиальных клеток; инкубируйте пробирки с створками примерно от 12 до 18 часов.

В растворе коллагеназы, при необходимости осторожно перемешивая. По окончании периода инкубации с помощью серологической пипетки аккуратно перемешайте перевариваемую ткань до гомогенизации клеточной суспензии. Такая гомогенизация способствует разрушению ткани и высвобождению интерстициальных клеток; центрифугируйте и промойте клетки так же, как это было показано для эндотелиальных клеток.

Вместо использования пяти миллилитров реанимирующей интерстициальной среды суспендируйте центрифугированные интерстициальные клетки в 15 миллилитрах интерстициальной среды и высейте клетки в колбу T 75, используя одну колбу для каждой центрифужной пробирки. Дайте клеткам расти не менее одного-двух дней перед заменой интерстициальной среды; ожидайте большего количества тканевого дебриса, чем при работе с эндотелиальными клетками. Кроме того, интерстициальные клетки по своей природе достигают конфлюэнтности быстрее, чем эндотелиальные, и обеспечивают более высокий выход клеток, что видно на этих репрезентативных изображениях.

Морфология культивируемых клапанных эндотелиальных клеток V Cs и клапанных интерстициальных клеток показана через два-три дня. Becs демонстрируют типичную эндотелиальную морфологию, при которой клетки имеют структуру «булыжной мостовой» и начинают образовывать кластеры.

Морфология VS.Exhibit схожа с морфологией миофибробластов, при которой клетки обычно имеют веретенообразную форму и располагаются редко при культивировании до кофлюэнтности; ECS демонстрируют типичную эндотелиальную морфологию, при которой клетки образуют структуру «булыжной мостовой», а рост ингибируется при контакте. VI CS демонстрируют морфологию, схожую с миофибробластами, при которой клетки обычно имеют веретенообразную форму и не подвержены контактному ингибированию. Функциональные характеристики как VEC, так и VIC могут быть определены по результатам окрашивания. Для ацетилированного поглощения LDL.

Клетки VEC характеризуются высоким уровнем поглощения ацетилированного LDL. В то время как клетки VIC характеризуются низким уровнем поглощения ацетилированного LDL, здесь представлены клеточные маркеры VEC и VIC. Клетки ECS окрашиваются положительно на фактор фон Виллебранда, в то время как

Окрашивание на фактор фон Виллебранда должно отсутствовать. Кроме того, в V CS окрашивание на альфа-гладкомышечный актин отрицательное, в то время как в V CS окрашивание на альфа-гладкомышечный актин положительное. Что ж, надеюсь, сегодняшний процесс выделения был для вас полезным.

Однако важно помнить, что базальная мембрана эндотелиальных клеток очень хрупкая, и любое нарушение целостности подлежащего матрикса часто приводит к высвобождению контаминирующих клеток из остальной части ткани. Для подтверждения успешного выделения критически важна характеристика, позволяющая оценить чистоту полученных изолятов. Желаем удачи.