Метод грызунов Всего культуры эмбрионов использованием Rotator типа бутылки культуры система
28 августа 2010 г.
Всего техника культуре эмбрионов позволяет мыши культуры и крысиных эмбрионов Исключая виво Состоянии в течение ограниченного периода соответствующее середине беременности этапов. В этом видео-протокол, мы демонстрируем наши стандартные процедуры крысы целая культура эмбриона после E12.5 использовании поворотного устройства типа бутылки системе культуры.
В биологии развития для проведения экспериментов используются различные животные. Техника культивирования эмбрионов была разработана в 1950-х годах и развивалась до появления современных методов генетических манипуляций. Точечное воздействие на определенные области зародыша с помощью микроинъекций или трансфекции генов стало возможным благодаря возможности манипулировать эмбрионами под микроскопом, в связи с чем культивирование целого эмбриона является очень полезным инструментом.
Для изучения динамики процесса развития эмбрионов млекопитающих после имплантации необходимо учитывать, что их рост критически зависит от функционального плацентарного аппарата, что ограничивает период культивирования. Как правило, культивирование эмбрионов возможно в период с 8,5 по 14,5 эмбриональный день у крысы и с 6,5 по 12,5 эмбриональный день у мыши.
В лаборатории мы культивируем эмбрионы крыс и мышей, используя систему ротационного культивирования. Эта система культивирования является наиболее распространенной и подходящей для выращивания эмбрионов крыс и мышей в период позднего гестационного развития, то есть после E 11.5 у крыс и E 9.5 у мышей.
В этом видео мы представим наш стандартный протокол культивирования эмбрионов крыс на стадии E 12.5. В данных условиях эмбрион может культивироваться в течение двух дней, чего вполне достаточно для изучения различных эффективных манипуляций при культивировании органов. Для достижения успеха необходимо выполнить два критически важных этапа.
Во-первых, процедура препарирования должна быть точной, чтобы не повредить эмбрион, особенно стержневые сосуды. Во-вторых, процедура должна быть максимально быстрой, что особенно важно для эмбрионов на более поздних стадиях развития.
Например, в случае эмбрионов мыши на стадии E 10.5 перенос следует осуществить в течение 30 минут. Мы применили метод культивирования целого эмбриона для эмбрионов мутантов по гену Pax6. Так, мы анализировали характер миграции нейроэпителиальных клеток у мутантов путем мечения небольшого количества клеток красителем или путем трансплантации меченных клеток в эмбрионы дикого типа и на мутантном фоне.
Кроме того, нами был разработан метод переноса генов в культивируемые эмбрионы мышей и красных эмбрионов с помощью электропорации, основанной на воздействии электрического тока. Это позволяет нам просто вводить конструкции экзогенных генов, доминантно-негативные формы и siRNAs в область развивающегося мозга. Таким образом, мы можем легко анализировать функции генов с помощью экспериментов по потере функции (loss of function) и усилению функции (gain of function).
Мы также исследуем поведение клеток, меченных GFP или RFP, используя культивирование органов или срезов, или же культивирование тканей. Таким образом, вы можете проводить самые разные эксперименты, используя культивирование ex vivo в сочетании с другими методами.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данном видеопротоколе демонстрируется методика культивирования целого эмбриона крысы после стадии E12.5 с использованием системы культуральных флаконов роторного типа. Этот метод позволяет проводить культивирование ex vivo в критические периоды среднего этапа гестации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Биология развития
- Эмбриология
- Методы культивирования ex vivo
Теоретические основы
- Метод культивирования целого эмбриона был разработан еще в 1950-х годах.
- Он позволяет проводить манипуляции с эмбрионами для генетических исследований.
- Эмбрионы могут культивироваться в определенные периоды развития.
- Рост зависит от функционального состояния эмбриона.
Цель исследования
- Изучение динамических процессов развития эмбрионов после имплантации.
- Предоставление стандартизированной процедуры культивирования целого эмбриона.
- Содействие исследованиям в области биологии развития.
Используемые методы
- Метод культивирования целого эмбриона
- Система культивирования в бутылях роторного типа
- Условия ex vivo для эмбрионов крысы
- Периоды культивирования с 8,5 по 14,5 эмбриональный день
Основные результаты
- Успешное культивирование эмбрионов крысы после стадии E12.5.
- Демонстрация стандартных процедур манипуляций с эмбрионами.
- Понимание критических периодов роста эмбрионов.
- Разработка надежного метода для последующих исследований.
Выводы
- Метод культивирования целого эмбриона является ценным инструментом в биологии развития.
- Он позволяет изучать развитие эмбриона в контролируемых условиях.
- Стандартизированные методы повышают воспроизводимость исследований.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Система культуры целого эмбриона (WEC) роторного типа позволяет осуществлять прямое манипулирование и наблюдение за эмбрионами грызунов на критических стадиях середины гестации, что способствует снижению механистических рисков на ранних этапах поиска. Эта ex vivo платформа обеспечивает возможность точного генетического и клеточного вмешательства, облегчая функциональную валидацию мишеней и исследование сигнальных путей перед проведением исследований in vivo. Ее воспроизводимость и адаптивность делают ее ценным инструментом для трансляционных исследований и приоритизации портфеля проектов при моделировании развития и заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Позволяет проводить прямое генетическое или клеточное манипулирование для функциональной валидации мишеней в эмбрионах млекопитающих.
- Способствует снижению механистических рисков, обеспечивая возможность проведения исследований потери и усиления функции в контролируемой системе ex vivo.
- Облегчает уточнение путей передачи сигнала и проверку гипотез в ключевых точках перегиба развития.
- Предоставляет платформу для оценки влияния потенциальных методов вмешательства на эмбриональное развитие.
Скрининг и разработка анализа
- Позволяет подготавливать валидированные, доступные для манипуляций эмбриональные системы для последующего фенотипического скрининга или анализа механизмов действия.
- Обеспечивает воспроизводимую количественную оценку результатов развития после генетического или химического воздействия.
- Способствует стандартизации и масштабируемости анализа для сравнительных исследований различных генотипов или воздействий.
- Позволяет проводить надежную оценку функции соединений или генов в физиологически релевантном контексте.
Трансляционные и доклинические исследования
- Соответствует стадиям развития, значимым для заболевания, что позволяет моделировать врожденные расстройства или функции генов.
- Обеспечивает преемственность от этапа первичного поиска до доклинической валидации за счет возможности проведения механистических исследований в интактных эмбрионах.
- Поддерживает принятие решений о дальнейшем продвижении с учетом рисков, выявляя недостатки в развитии на ранних этапах разработки.
- Способствует поиску и валидации биомаркеров в контролируемой, манипулируемой системе.
Интеграция конвейера и рабочих процессов
Система WEC роторного типа служит связующим звеном между этапом первичного поиска и доклиническими исследованиями, позволяя осуществлять направленные манипуляции на основе выдвинутых гипотез и проводить количественный анализ эмбрионального развития. Располагаясь между анализами in vitro и моделями in vivo, она представляет собой уникальную платформу для изучения механизмов и снижения рисков при определении терапевтических мишеней.
- Биология открытий: обеспечивает проверку гипотез и уточнение путей передачи сигнала посредством прямого генетического или клеточного вмешательства.
- Скрининг: предоставляет воспроизводимые эмбриональные системы, готовые к анализу, для количественной оценки фенотипических признаков.
- Аналитика: позволяет измерять результаты развития, миграции или молекулярные показатели для сравнительного анализа.
- Трансляционные исследования: связывают ранние результаты изучения механизмов с доклиническим моделированием заболеваний и валидацией биомаркеров.
- Корпоративное повторное использование: предлагает стандартизированную, адаптируемую платформу для многократного использования в рамках нескольких программ открытий.
Операционное и корпоративное влияние
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации мишени.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизированные, воспроизводимые и масштабируемые рабочие процессы ex vivo для исследований развития.
- Стратегическая ценность: Оптимизирует принятие решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и повышает эффективность использования капитала за счет раннего выявления биологических рисков.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение активов стадии поиска с учетом скорректированных рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области эмбриологии, микродиссекции и методов манипуляций ex vivo.
- Необходимы специализированное оборудование для культивирования в бутылях роторного типа и инфраструктура для микроскопии.
- Требуется строгая стандартизация между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Может потребоваться адаптация протокола для различных линий грызунов или стадий развития.
- Период культивирования ограничен зависимостью эмбриона от функций плаценты, что сужает временное окно анализа.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:00
The Method of Rodent Whole Embryo Culture Using the Rotator-type Culture System
2:06
Setting up Whole Embryo Culture System
3:53
Removal of Embryos from the Uterus
2:52
Preparation of Culture Medium
4:52
Dissection of Rat Embryos
7:27
Results and Discussion
0:07
Introduction
