Тестирование Protozoacidal активность лиганд-литических пептиды против термитов Gut Protozoa В пробирке (Protozoa культуры) и В естественных условиях (Микроинъекция в Термит кишке)

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать, что синтезированный лиганд специфически связывается с целлюлозолитическими простейшими в кишечнике подземных термитов вида Formosan, и что лиганд в сочетании с литическим пептидом уничтожает эти простейшие in vitro в анаэробной культуре простейших и in vivo путем инъекции в заднюю кишку термита. Это достигается путем первоначального выделения простейших из кишечника рабочих термитов в анаэробных условиях. Вторым этапом процедуры является подтверждение связывания конъюгата флуоресцентного лиганда с простейшими кишечника термитов in vitro.

Третий этап процедуры заключается в том, чтобы показать, что лиганд, конъюгированный с литическим пептидом, уничтожает простейших кишечника термитов in vitro. Заключительный этап процедуры состоит во введении флуоресцентно-меченого лиганда и лиганда, конъюгированного с литическим пептидом, в заднюю кишку термита для подтверждения связывания и уничтожения кишечных простейших in vivo. Используя инъекции культур простейших в заднюю кишку термита и флуоресцентную микроскопию, мы демонстрируем, что лиганд, конъюгированный с литическим пептидом, связывается с простейшими кишечника термитов и эффективно уничтожает их in vitro и in vivo.

Присоединение лиганда к литическому пептиду повысило токсичность по отношению к простейшим по сравнению с действием одного только литического пептида. Хотя это снизило токсичность для нецелевых организмов, таких как e coli, скорее всего, из-за того, что лиганд не связывался с бактериальной клеточной мембраной, гибель простейших приводит к смерти термитов менее чем за две недели. Представленный метод использования LIG литических пептидов для уничтожения симбиотических простейших в кишечнике подземных термитов является частью усилий по разработке альтернативных методов борьбы с термитами.

Термиты погибают, когда в их кишечнике отсутствуют симбионты, что делает их менее зависимыми от химических веществ. Мы извлекаем простейших из кишечника термитов, чтобы продемонстрировать, что лиганд связывается с простейшими, а литический пептид лиганда уничтожает их. Частицы древесины внутри простейших проявляют автофлуоресценцию. Поэтому важно сравнить результаты анализа простейших, обработанных флуоресцентным лигандом, с результатами для необработанных простейших.

Чтобы избежать ложноположительных результатов, мы вводим пептиды непосредственно в заднюю кишку, так как при скармливании пептидов термитам протеазы в средней кишке и ферменты передней кишки переварят их. Используя библиотеки фагового дисплея от New England Bio Labs, мы идентифицировали 19 последовательностей пептидов, которые связываются с простейшими. Мы выбрали один из лигандов с пептидной последовательностью, проявившей сходство с предполагаемыми гликопротеинами, известными из мембраны Trypanosoma brucei.

После синтеза пептида мы соединили синтезированный пептид с флуоресцентным зондом на C-конце с помощью твердофазного пептидного синтеза с использованием смолы E-D-A-N-S novatech для оценки литических свойств конъюгатов пептидов. В данной процедуре мы используем конъюгат синтезированного лиганда и литического пептида, который был предварительно синтезирован в белковом центре LSU за один день до проведения эксперимента. Используйте Sigma Coat для обработки всех используемых материалов, чтобы предотвратить адсорбцию простейших или пептидов на поверхностях.

Нанесите равномерный слой и дайте ему высохнуть в течение ночи перед использованием на следующий день. Установите вентиляционный блок в перчаточном боксе для постоянной циркуляции воздуха комнатной температуры через осушитель и пакеты с катализатором типа D в течение более одного часа для снижения уровня влажности и содержания кислорода. Заполните перчаточный бокс непрерывным потоком азота в течение 20–30 минут и при необходимости используйте дополнительный азот для поддержания анаэробных условий.

Затем приготовьте среду Traeger U и доведите pH до 7. Профильтруйте стерилизованную среду в перчаточном боксе с помощью наконечника объемом 200 µL, подключенного к трубке со смесью 2,5% водорода, 5% углекислого газа и 92,5% азота, в течение одного часа для удаления остатков кислорода в перчаточном боксе. После подготовки материалов с помощью пинцета возьмите рабочую особь термита из чашки Петри и полностью погрузите ее тело в стакан с 70% этанолом, осторожно удерживая термита пинцетом примерно в течение 10 секунд. Чтобы удалить поверхностные загрязнения, извлеките особь из этанола и дайте ей высохнуть на чистой салфетке Kimwipe в течение примерно 20 секунд.

В перчаточном боксе подготовьте силилизированный предметное стекло с 100 µL среды Trager U для сбора кишечника термита и пробирку с 900 µL среды Trager U для сбора простейших. Затем, используя диссекционный микроскоп и стерильный пинцет с тонкими концами, зафиксируйте брюшко рабочего термита и захватите кончик брюшка другим пинцетом, чтобы осторожно вытянуть кишечник вверх или вниз под углом 45 градусов; постарайтесь извлечь среднюю и заднюю кишки одним целым фрагментом. Поместите извлеченные средние кишки в каплю 100 µL среды Trager U на предметное стекло.

Затем перенесите образец на предметное стекло. Проколите заднюю кишку парой стерильных тонких диссекционных зондов, чтобы высвободить простейших, и осторожно перенесите содержимое кишечника пипеткой объемом 200 µL в микроцентрифужную пробирку объемом 1 мл, содержащую 900 µL среды Traeger. Подождите пять секунд для осаждения фрагментов стенки кишечника и перенесите 900 µL супернатанта в новую пробирку. Перенесите 10 µL культуры простейших на микроскоп с sigma-покрытием.

Поместите препарат на предметное стекло и проверьте состояние простейших под микроскопом при 200-кратном увеличении. Сразу после получения простейших подготовьте контрольные культуры аэробных простейших: tetra piriformis, амеб, ug, gleaner и инфузорий-туфелек, а также ночную культуру e coli в питательной среде, рекомендованной поставщиком; зафиксируйте простейших из кишечника термитов, любые другие контрольные простейшие и e coli 10% формальдегидом при температуре 4 °C в течение 12 часов. Затем центрифугируйте раствор простейших при 30 ×g в течение 10 минут.

Удалите супернатант и дважды промойте осадок, содержащий фиксированные простейшие, одним миллилитром среды Trager U. Ресуспендируйте осадок в одном миллилитре среды Trager. Инкубируйте фиксированные микроорганизмы от одного до двух часов со 100 µL раствора синтезированного лиганда, конъюгированного с флуоресцентным красителем E-D-A-N-S, при конечной концентрации лиганда 50 µM в воде. Рассматривайте микроорганизмы, обработанные лигандами, и необработанные контроли под флуоресцентным микроскопом при 400-кратном увеличении с максимумом поглощения на 341 nm и эмиссией в синей области на 471 nm.

Для оценки литических свойств пептида, конъюгированного с лигандом, перенесите пипеткой шесть аликвот по 198 µL культуры простейших, приготовленной согласно разделу три, в пробирки типа «эппендорф» объемом 0,5 мл. В половину аликвот культуры простейших кишечника термитов добавьте 2 µL 100 µM раствора литического пептида с лигандом. Для достижения конечной концентрации 1 µM в остальные аликвоты в качестве контроля добавьте 2 µL стерильной воды.

Через один час перенесите по 10 µL каждой культуры простейших на предметное стекло. Сравните выживаемость простейших, обработанных литическим пептидом, конъюгированным с лигандом, с контрольной группой под микроскопом при 200-кратном увеличении. Изготовьте вытягивающие иглы с помощью микропипеточного вытягивателя NGI PC 10 с двухступенчатым уровнем нагрева. Для получения размера кончика от 20 до 30 мкм подтвердите размер кончика, измерив его под микроскопом.

С помощью микрометра заполните одну иглу примерно 30 µL 50 µM флуоресцентно меченого лиганда в водной суспензии. С помощью прикрепленного шприца заполните другую иглу водой для контроля. Установите микропипетку в держатель и микроманипулятор. Закрепите иглу в держателе системы инъекций во втором микроманипуляторе.

Установите начальные параметры инъекции: длительность импульса примерно одну секунду и давление впрыска от 10 до 12 PSI. Затем медленно введите иглу в микропипетку и введите раствор, нажав на ножную педаль. Извлеките микропипетку и зафиксируйте длину введенного раствора.

С помощью штангенциркуля рассчитайте объем инъекции на основе известных параметров микропипетки, после чего отрегулируйте давление и длительность импульса так, чтобы выдавить 0,3 µL раствора. Затем подготовьте по 20 термитов для каждой группы обработки для проведения инъекций. Сначала аккуратно сожмите конец брюшка мягким пинцетом, чтобы удалить любые экскременты, находящиеся в прямой кишке.

Затем иммобилизируйте рабочих термитов, выдержав их на льду в течение пяти минут до полной иммобилизации. Изготовьте приемники для удержания рабочих термитов, отрезав наконечники дозаторов на 100 мкл. С помощью лезвия скальпеля обрежьте наконечник до длины 10–12 мм, подберите размер в соответствии с размером термитов и поместите их в флакон.

С помощью винта закрепите приемник на микроманипуляторе. Поместите рабочего термита на чашку Петри брюшной стороной вверх и с помощью азотного вакуумного насоса всосите его в приемник головой вперед, так чтобы задний конец тела рабочего термита выступал из приемника. Осторожно удерживая термита в приемнике, с помощью микроманипулятора продвиньте заполненную иглу, чтобы ввести ее в анальное отверстие рабочего термита. Введите 0.3 µL флуоресцентно помеченного лиганда или воды в качестве контроля.

Поместите рабочих особей, которым ввели лиганд или воду, в отдельные чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой и выдержите их в течение ночи при температуре 26 °C и относительной влажности 78%. Через 24 часа извлеките кишечник из инъецированных термитов и соберите протозооиды, как было описано ранее. С помощью флуоресцентной микроскопии пронаблюдайте связывание лиганда в протозооидах термитов для оценки литических свойств конъюгированных с лигандом литических пептидов в живых организмах.

Подготовьте материалы для инъекций, оборудование и термитов, как это делалось ранее для проведения инъекций, и введите 0,3 µL раствора литического пептида с лигандом в концентрации 500 µM или воду в качестве контроля в заднюю кишку 20 рабочих термитов. Через 24 часа извлеките кишечник из нескольких рабочих особей и исследуйте содержимое кишечника под микроскопом при 200-кратном увеличении, как только будет подтверждена гибель всех простейших в кишечнике обработанного термита. Оставшихся обработанных термитов и контрольную группу содержите в чашках Петри с влажной фильтровальной бумагой и ежедневно регистрируйте смертность. Мы подтверждаем, что лиганд, соединенный с флуоресцентным зондом, связывается со всеми тремя видами простейших: p grassi, h, heart, mani и sla.

В заднем кишечнике четырех видов подземных термитов обнаруживались детектируемые плотности; связывание лиганда происходит по всей поверхности клетки и концентрируется в передней области простейших по оси, где расположены слой микротрубочек и ядро. Мы также обнаружили флуоресценцию во всех протестированных видах свободноживущих аэробных простейших, что позволяет предположить, что лиганд связывается со структурами, общими для простейших. В то время как связывание лиганда с E. coli не наблюдалось, один микромоляр литического пептида-лиганда уничтожил все три вида простейших из кишечника рабочих особей подземных термитов, а также свободноживущих T. piriformis in vitro менее чем за 10 минут, в то время как контрольная группа осталась жива.

На этом изображении показана прогрессирующая потеря целостности мембран простейших кишечника термитов при воздействии литического пептида с лигандом. Разницы в количестве колоний e coli между воздействием литического пептида с лигандом и водой обнаружено не было; однако литический пептид без лиганда значительно сократил количество колоний e coli. Это позволяет предположить, что присоединение лиганда к литическому пептиду в некоторой степени защищает нецелевые микроорганизмы от лизиса. Инъекция 0.3 µL 500 µM литического пептида с лигандом привела к гибели всех трех видов простейших в кишечнике верхних и подземных термитов в течение 24 часов, а сами термиты погибли через 10 дней после инъекции литического пептида с присоединенным лигандом.

Простейшие и термиты погибали в три раза быстрее, чем при введении литических пептидов без конъюгации с лигандом, как показано в работе Husen и Colia (2009), что свидетельствует о том, что лиганд повышает цидальную эффективность литических пептидов в отношении простейших при оптимальных условиях культивирования. Все три вида простейших, выделенных из кишечника подземных термитов Omo, должны оставаться живыми и здоровыми в течение как минимум трех дней.

Однако, если в среде остаются остатки кислорода, движение протозоев немедленно прекращается. Если используется неправильная среда и осмотическое давление в клетках становится слишком высоким, мембраны протозоев раздуваются, и они разрываются. Если осмотическое давление в клетках становится слишком низким или мембраны повреждаются, протозои сморщиваются и сжимаются. Фиксация протозоев облегчает обнаружение связывания флуоресцентно-меченого лиганда с протозоями.

Обнаружить флуоресценцию и отличить ее от автофлуоресценции частиц древесины затруднительно, когда протозои свободно передвигаются. После освоения данной методики при помощи ассистента можно вводить препарат примерно 30 термитам в час. Хотя лигандный колитический пептид был разработан для уничтожения протозойных симбионтов в кишечнике подземных термитов и, следовательно, для борьбы с термитами, он также может быть полезен при разработке препаратов против протозойных паразитов, таких как slash mania, ponoma, te и odium, вызывающих множество заболеваний у людей.

После просмотра этого видео вы должны будете хорошо понимать, как получать и поддерживать в культуре простейших, выделенных из кишечника термитов, как с помощью флуоресцентной микроскопии продемонстрировать специфическое связывание лиганда с простейшими, а также как доказать действие лиганда — колитического пептида — как «протосуицидального» агента in vitro. И, наконец, вы узнаете, как вводить пептиды в кишечник термитов для подтверждения результатов in vivo.