Роговицы конфокальной микроскопии: Роман неинвазивной техники количественно Малый Fibre патологии периферической нервной системы

В данном видео демонстрируется процедура визуализации С-волокон роговицы с помощью неинвазивного метода конфокальной микроскопии роговицы (КМР), позволяющего количественно оценить повреждение нервных волокон. Сначала настраивается фокальная плоскость линзы КМР, и перед установкой одноразового колпачка на линзу наносится вискотеарный гель. Затем в глаз закапывают анестетик и наносят вискотеарный гель.

Затем камера настраивается так, чтобы гель на передней части линзы контактировал с роговицей пациента. В завершение регулируется глубина фокальной плоскости и фиксируются изображения нервов роговицы из центральной части слоя Боумена. Морфологические изменения нервных волокон роговицы могут быть использованы для количественной оценки нейропатии.

Это совершенно новый метод, который ранее применялся в оптометрии и офтальмологии, однако на протяжении последних восьми лет мы очень эффективно использовали его для изучения и оценки диабетической нейропатии и других периферических нейропатий. Главное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет количественно оценить повреждение малых волокон на очень ранней стадии, а затем полностью неинвазивно стратифицировать степень тяжести нейропатии у пациентов. Мы можем сделать это очень быстро с помощью двухминутного сканирования, результаты которого затем количественно интерпретируются с точки зрения тяжести нейропатии; таким образом, мы надеемся, что этот метод заменит некоторые другие, гораздо более инвазивные методы, такие как биопсия кожи и биопсия нерва. Несмотря на то, что в целом метод кажется простым, на самом деле он требует соблюдения определенных этапов для оптимального получения и последующего количественного анализа изображения.

Наша цель — сделать весь этот процесс понятным и доступным для любого, кто пожелает использовать данный метод. Первым этапом обследования с помощью корнеального конфокального микроскопа HRT является подготовка наконечника объектива в трубке объектива сканирующей лазерной камеры. Установите рефракцию на +12 диоптрий, затем переместите камеру в самое нижнее положение и зафиксируйте линзу, повернув её против часовой стрелки.

Нанесите крупную однородную каплю ViscoTears размера P без пузырьков воздуха на кончик линзы. Извлеките колпачок для томографии из стерильного контейнера и установите его на кончик линзы, продвигая максимально глубоко на держатель, чтобы гель образовал мениск между объективом и колпачком. Будьте осторожны, чтобы не коснуться передней поверхности колпачка во время установки.

Теперь переместите камеру лазерного сканирования максимально назад по креплению камеры до внутренней и внешней поверхностей томо-колпачка. Обе поверхности должны отображаться на мониторе в виде яркого лазерного отражения. Вращайте колесо регулировки фокальной плоскости до появления яркого отражения, что указывает на фокусировку линзы на передней части колпачка.

Значение глубины, отображаемое на дисплее положения фокуса, теперь должно находиться в диапазоне от минус 150 micrometers до плюс 150 micrometers. Сбросьте настройку глубины на ноль. Теперь разберем, как подготовить пациента.

После анестезии глаз испытуемого каплей 0,4% гидрохлорида тетракаина увлажните переднюю поверхность глаза вискослезами. Расположите испытуемого удобно, чтобы его подбородок лежал на подбородочнике, а лоб был плотно прижат к лобному упору. Осмотр облегчается, если попросить пациента сфокусировать взгляд на внешнем фиксирующем источнике света.

Компактный размер головки микроскопа гарантирует, что при обследовании одного глаза контрлатеральный глаз субъекта не будет перекрыт. Это позволяет использовать дистанционные мишени. Расположите ПЗС-камеру таким образом, чтобы её оптическая ось была перпендикулярна оптической оси сканирующей лазерной камеры.

При съемке правого глаза камера должна находиться с правой стороны пациента, и наоборот. В этом положении передняя поверхность колпачка томографа видна в центре ПЗС-камеры. Изображение в реальном времени.

Перемещайте камеру лазерного сканирования к пациенту до тех пор, пока роговица пациента не окажется на расстоянии примерно от 5 до 10 мм от томо-колпачка. Затем с помощью ручек регулировки вертикального и горизонтального доступа на креплении камеры перемещайте камеру лазерного сканирования вверх-вниз и влево-вправо, пока томо-колпачок не окажется в центре роговицы пациента. Теперь попросите пациента открыть глаза как можно шире.

Медленно перемещайте камеру лазерного сканирования к пациенту до тех пор, пока колпачок томографа не коснется роговицы пациента. На этом этапе убедитесь, что красный лазерный луч находится в центре роговицы и что отражение лазерного луча от роговицы происходит точно на переднем полюсе роговицы. При оптимальной настройке контакт между линзой и роговицей минимален.

На изображении с ПЗС-камеры в реальном времени виден тонкий гелевый мостик между томо-колпачком и роговицей. Если давление между томо-колпачком и роговицей слишком велико, то на ПЗС-камере роговица выглядит уплощенной. Изображение в реальном времени и артефакты отображаются на ПЗС-изображении.

После позиционирования пациента включите лазерную камеру HR three; на экране появится окно сбора изображений. Используйте изображение с ПЗС-матрицы для центрирования томо-колпачка и лазерного луча относительно роговицы пациента. CCM имеет три варианта захвата изображений.

Последовательное сканирование позволяет получить до 100 изображений с регулируемой частотой кадров. Выбирается частота кадров от 1 до 30 кадров в секунду. На основании этого может быть записано видео продолжительностью от 3 до 100 секунд.

В режиме объемного сканирования камера автоматически делает серию из 40 изображений в последовательных фокальных плоскостях. Общая глубина сканирования составляет 85 micrometers, а фокусное расстояние между двумя последовательными изображениями составляет примерно 2.1 micrometers. Последним вариантом является режим сечения, который будет использоваться в данном эксперименте.

Этот режим обеспечивает оптимальную визуализацию с получением и сохранением четких одиночных изображений при каждом нажатии ножной педали. Данный режим используется для захвата изображений всего слоя роговицы, включая слой Боумена в центре роговицы. После получения достаточного количества изображений можно использовать другие режимы, включая последовательный (sequence) и объемный (volume).

После нескольких сканирований можно изменить фокальную плоскость объектива, чтобы измерить глубину слоя клеток роговицы относительно ее поверхности: для этого необходимо сфокусироваться на слое эпителиальных клеток, а затем нажать кнопку сброса, чтобы установить значение глубины на ноль. По завершении обследования выключите камеру, нажав кнопку питания камеры в окне сбора данных. Предупредите пациента о том, что ему не следует тереть глаза до тех пор, пока не закончится действие местной анестезии.

Снимите колпачок для томографии с камеры, утилизируйте его, а затем очистите линзу микроскопа ватной палочкой, смоченной дистиллированной водой. Теперь рассмотрим, как анализировать изображение и количественно определять параметры нервных волокон для просмотра и анализа существующих обследований. Сначала выберите соответствующую запись пациента в окне базы данных.

Окно просмотра изображений предоставляет обзор существующих результатов обследований роговицы выбранного пациента. Обследования, проведенные в разные дни, хранятся во вкладках отдельных визитов. Три различных типа сканирования представлены тремя разными значками. Вкладка визита для трех видов исследования роговицы в окне просмотра изображений программы Heidelberg Eye Explorer.

Для осмотра изображения роговицы дважды щелкните по соответствующему значку изображения, затем нажмите «show now», чтобы экспортировать нужные изображения для дальнейшего анализа; нажмите «export» на панели инструментов и выберите папку для сохранения изображений. Поскольку основным объектом данного исследования являются передняя пограничная мембрана (слой Боумена) и роговичные нервы, анализироваться будут только изображения этого слоя. Для каждого субъекта выбирается от пяти до шести кадров слоя Боумена на разной глубине роговицы.

Анализ изображений проводится с помощью специализированного программного обеспечения CCM Image Analysis Tools версии 0.64, разработанного нашей группой. С помощью данной программы измеряются основные параметры роговичных нервов: плотность нервных волокон, которая определяется как количество основных нервов на кадр, и плотность разветвления нервов, представляющая собой общее количество основных ветвей на кадр.

Длина нервных волокон представляет собой суммарную длину основных нервов и их главных ветвей на один кадр нервных волокон. Извилистость — это показатель извилистости основных нервов на один кадр. Чтобы открыть изображение CCM, перейдите в меню «File» (Файл), а затем выберите «Open» (Открыть).

После загрузки изображения его размер и тип отображаются в окне информации об изображении в верхней левой части панели управления; в строке редактирования этой информации отображается масштаб по умолчанию. Если масштаб отличается, измените числовое значение в строке редактирования. Чтобы начать анализ изображения, выберите измеряемый параметр в окне метрик в верхней правой части панели управления.

В окне результатов в нижней части страницы NFD и MBD представлены в виде абсолютных значений. NFL представлена в миллиметрах, а извилистость — в виде коэффициента извилистости. Результаты могут быть экспортированы в таблицу Excel.

При открытии страницы Excel результаты будут представлены в количестве на квадратный миллиметр для NFD, в миллиметрах на квадратный миллиметр для NFL и в виде коэффициента извилистости для NFT. Чтобы выполнить эти измерения, сначала отметьте каждый основной нерв, затем отметьте каждую основную ветвь нерва. В завершение обведите каждый нерв в кадре.

Для повышения точности можно использовать цифровую ручку. При должном навыке и правильном выполнении данной процедуры эта техника занимает одну минуту. Важно строго следовать приведенным инструкциям.

Мы надеемся, что после просмотра данного видео вы получили четкое представление о том, как выполнять съемку и получать изображения перемещающего слоя роговицы с помощью корнеальной конфокальной микроскопии, а также как проводить количественную оценку и анализ изображений этого слоя у пациентов с периферической нейропатией, в частности при диабетической нейропатии. И не забывайте, что работа с ККМ требует специальной подготовки, поэтому рекомендуется, чтобы процедуру проводили специалисты, прошедшие обучение методам обследования глаз.