Колония Формирование Cell (CFC) Пробирной по правам гемопоэтических клеток

Эта процедура оценивает в полутвердой среде способность гемопоэтических предшественников к пролиферации и дифференциации по различным гемопоэтическим линиям для начала культивирования. Свежеразмороженные CD-34 положительные клетки в присутствии цитокинов способствуют активации через два дня. Выполните ретровирусную трансдукцию тест-конструкции GFP, добавив активированные CD-34-положительные клетки в пластину, предварительно загруженную вирусом.

Через 48 часов изолируют GFP-положительные клетки по факсу, затем помещают эти клетки в полутвердую среду метилцеллюлозы с добавлением факторов роста и инкубируют в течение примерно двух недель, пока на поверхности не появятся колонии. Наконец, соберите колонии, обездвижьте клетки на предметных стеклах с помощью цитозина и окрашивайте правой гизой для микроскопического определения гемопоэтической линии и стадии созревания. Этот метод может обеспечить механистическое понимание в исследованиях лейкемогенеза, а именно влияния онкогенов на дифференцировку кроветворения.

Чтобы быстро увидеть культуру, разморозьте флакон с замороженными CD-34-положительными клетками при температуре 37 градусов Цельсия, осторожно встряхивая до тех пор, пока не останется последний маленький кристалл льда, и перенесите клеточную суспензию в 50-миллилитровую коническую пробирку. Аккуратно смойте оставшиеся клетки из флакона одним миллилитром комнатной температуры, 2% F-B-S-I-M-D-M и добавьте его по каплям в 50-миллилитровую пробирку, осторожно помешивая. Теперь подождите три минуты.

Продолжайте, медленно добавляя два миллилитра среды, аккуратно перемешивая, и снова уравновешивайте в течение трех минут. Повторите эту процедуру, добавляя в разбавленную клеточную суспензию среды равного объема с интервалом в три минуты, осторожно поворачивая между добавлениями до тех пор, пока конечный объем не достигнет 32 миллилитров для сбора клеток, центрифугируйте при 250 G в течение 10 минут при комнатной температуре и удалите супернат, оставив после себя около 0,5 миллилитров среды над гранулой. Приступайте к промывке клеток один раз, суспензив гранулу в 20 миллилитрах среды и центрифугируя при 200 G в течение восьми минут При комнатной температуре удалите сменяемые и суспензируйте клетки в полной среде IMDM в концентрации примерно полмиллиона клеток на миллилитр.

Наконец, чтобы определить концентрацию клеток, возьмите 10 микролитров суспензии в микропробирку, смешанную с таким же объемом 0,4% раствора трианного синего цвета, и подсчитайте. С помощью гемоцитометра разбавляют клетки до 10-5 клеток на миллилитр путем добавления полной среды IMDM с добавлением смеси активирующей культуры цитокинов, клетки в увлажненном инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом в течение двух дней в день трансдукции подсчитывают клетки до начала предварительной загрузки вируса для определения количества лунок, которые должны быть подготовлены для подготовки 24 лунок к необработанной культуре тканей. Добавьте в каждую лунку по 400 микролитров по 25 микрограмм на миллилитр, раствор ретро-актина и инкубируйте в течение двух часов при комнатной температуре в ламинарном проточном биозащитном колпаке.

Удалите раствор ретро-актина и закодируйте каждую лунку 2% BSA путем инкубации в течение 30 минут при комнатной температуре. Тем временем разморозьте вирусные исходные растворы и храните на льду. Затем аспирируйте вирус с загрузкой раствора БСА, добавив 0,5 миллилитра вирусного препарата в каждую лунку, и центрифугируйте при 2200 G при четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Удалите вирусный раствор из лунок и повторите загрузку вируса еще три раза. Наконец, промойте каждую лунку холодной средой IMDM. Теперь соберите предварительно активированные CD 34 положительные клетки центрифугированием и ресуспендируйте клетки в свежей полной среде IMDM с добавлением цитокинов аликвот 0,15 миллиона CD 34 положительных клеток в каждую из вирус закодированных лунок, лунок и инкубируйте во увлажненном 37 градусе Цельсия инкубаторе с 5% углекислым газом в течение двух дней, чтобы аккуратно и тщательно собрать трансдуцированные клетки.

Суспензируйте клетки из вирусных плавающих пластин и отфильтруйте суспензию через клеточный фильтр толщиной 50 мкм в коническую трубку. Возьмите 10 микролитров клеточной суспензии в микропробирку. Смешайте с равным объемом раствор трианового синего и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра.

Промойте каждую лунку 0,8 миллилитрами холодного HBSS с 0,02% ЭДТА и добавьте в ту же сборную пробирку через 50-микронный фильтр CEL Trix. Гранулируйте ячейки центрифугированием и промойте один раз холодным HBSS. Повторно суспендируйте конечную клеточную гранулу в HBSS с 1% БА и держите клетки на льду в темноте для последующей сортировки клеток, которая обычно выполняется на высокоскоростной сортировочной установке для ядра ядра на основе экспериментального дизайна.

Разморозьте необходимое количество аликвот пробирной среды для анализа ХФУ, энергично перемешайте и дайте пробирке постоять не менее пяти минут, чтобы пузырьки поднялись на поверхность, прежде чем добавлять клетки. Теперь возьмите 3000 вирусных трансдуцированных отсортированных клеток в стерильную микропробирку, содержащую холодные 2% F-B-S-I-M-D-M среды и отрегулируйте конечный объем суспензии до 0,3 миллилитров. Приостановите клетки и переложите всю клеточную суспензию в трехмиллилитровую аликвоту метиловой культовой среды для роста.

Создайте однородную клеточную суспензию путем энергичного вортекса. Дайте трубке постоять неподвижно в течение трех минут. Для того, чтобы покрыть клетки, прикрепите иглу 16 калибра с тупым концом к трехмиллилитровому шприцу и наберите 2,2 миллилитров.

Стараясь не допустить попадания крупных пузырьков, вытолкните по 1,1 миллилитра в две 30-миллиметровые чашки для необработанных культур тканей и равномерно распределите смесь, вращая поместите дубликаты пластин в 100-миллиметровую тарелку вместе с миской для воды. Продолжая три литра стерильной воды культуры в течение двух недель. Охарактеризовать и оценить колонии в соответствии с их морфологией с помощью инвертированного микроскопа при 40-кратном увеличении в чашке для культур, помеченной сеткой для подсчета очков.

Для документирования результатов культивирования сканируют всю пластину для анализа ХФУ с помощью обычного сканера при давлении 600 DPI и делают маломощные фотоснимки репрезентативных колоний с помощью инвертированного микроскопа, оснащенного цветной камерой для дальнейшего анализа дифференцировки и пролиферации, из всей пластины для анализа ХФУ восстанавливаются путем суспендирования в нескольких объемах комнатной температуры 2%F-B-S-I-M-D-M промываются и подсчитываются для морфологического анализа. Перенесите 30 000 клеток, которые были извлечены из планшетов для анализа ХФУ, на предметное стекло. Используя центрифугу STOs, высушите предметные стекла на воздухе в течение ночи, чтобы эффективно окрашивать предметные стекла.

Настройте сборочную линию из девяти емкостей для окрашивания, содержащих растворы в следующем порядке. Абсолютный метанол правый исходный раствор гемса правильный буфер гемс, 50% метанол и вода, два сосуда с фосфатным буфером pH шесть и, наконец, два сосуда с водой. Поместите предметные стекла в держатель предметного стекла и окуните его в абсолютный метанол на две минуты и считайте кровью избыток метанола.

Немедленно опустите держатель слайда и запишите стоковый раствор gemsa на пять минут. Переложите носитель в правый буфер gemsa pH 6,4 и инкубируйте в течение 10 минут. Дважды опустите носитель в 50% метанол 10 раз в воду, еще 10 раз в следующий сосуд для воды, а затем пять раз в фосфатный буфер.

рН 6,0. Переложите переноску в воду и выдержите в течение двух минут. Повторите стирку в последней емкости с водой.

Теперь дайте предметным стеклам полностью высохнуть на воздухе в переноске. Снимите каждую горку и протрите заднюю часть предметного стекла пропитанными метанолом салфетками Kim, чтобы удалить пятна. Поместите каплю cyto seal 60 и покровное стекло для герметизации.

Выполните дифференциальный подсчет 500 клеток для каждого устойчивого предметного стекла GM с помощью микроскопа. Для целей данного эксперимента клетки разделены на пять категорий: примитивные клетки, промежуточные миелоидные клетки, зрелые миелоидные клетки, промежуточные эритроидные клетки и зрелые эритроидные клетки. Например, по сравнению с контрольной экспрессией новых 98 ястребов, девятилетний онкоген увеличивал образование красных эритроидных колоний.

Это влияние онкогена на рынок ясно проявляется при наблюдении колоний при малом увеличении. Дальнейшее морфологическое исследование с помощью GEM sustaining дает информацию о происхождении и степени созревания клеточной популяции. В данном примере введение новых 98 Hawks, девятка вызвала общее увеличение числа клеток с эритроидной гиперплазией и ингибирование созревания как эритроидных, так и миелоидных клеток.

Этот SA дает представление о дифференцировке гемопоэтических клеток путем измерения способности входного клеточного препарата к пролиферации, дифференцировке и образованию колоний в полутвердой среде.