Протокол денге инфекций в Комары (A. aegypti) и определение инфекции Фенотип

Меня зовут Джордж Димопулос, и сейчас мы покажем вам процедуру заражения комара Aidas GTI вирусом денге. И первое, что нам нужно сделать, это размножить вирус в клеточной линии Aidas Aus. Меня зовут Хосе Луис Рамирес, и я учусь в аспирантуре в лаборатории OUS.

Для этой процедуры нам понадобится установка BSL two с колпаком для культуры тканей, инкубатор CO2, установленный при температуре 37 градусов по Цельсию. Нам понадобятся пластиковые конические трубки объемом 50 мл. Нам нужна человеческая сыворотка, нам нужна водяная баня, 37 градусов по Цельсию, центрифуга.

Нам нужны 96 луночных планшетов и другие стандартные молекулярные биология и биохимия, реактивы и расходные материалы. Итак, это обычный капюшон для культуры тканей в учреждении BSL 2, и первым шагом является извлечение клеток, которые выросли до 80% беглости в колбе площадью 75 квадратных сантиметров. Это МЭМ-среда с 10% тепла, тепла и активированной фетальной бычьей сывороткой с добавлением 1% L-глутамина и заменимых аминокислот.

Хорошо, теперь мы добавим вирус Денге в клетки. Мы вынули запас вируса из морозильной камеры при температуре минус 80 градусов и разморозили его в инкубаторе при температуре 37 градусов. Мы добавляем в клетки около 0,5 миллилитров стокового вируса, чтобы достичь концентрации около 1,5 вирусных частиц на клетку.

Затем клетки помещают в шейкер примерно на 15 минут с медленной скоростью встряхивания. Далее клетки помещают в СО2-инкубатор примерно на 45 минут. При 37 градусах Цельсия концентрация СО2 составляет 5%После 45-минутной инкубации мы вынимаем клетки и добавляем 30 мл среды, а затем снова помещаем клетки в инкубатор и инкубируем еще пять дней.

Теперь подготовим вирусные частицы к заражению. Сначала нам нужно отделить клетки от колбы скребком, а затем перенести их вместе с фильтром в коническую пробирку объемом 50 мл. Теперь у нас есть центрифужные ячейки со скоростью 12 000 об/мин в течение 10 минут для их гранулирования.

На дне этой бутылки можно увидеть гранулы. Далее мы удалим надосадочную жидкость и оставим с клетками только один мл, чтобы выпустить вирус из клеток. Мы их заморозим.

Это приведет к разрыву клеток, и тогда мы разморозим их, а затем снова заморозим, и мы повторим эту процедуру три-четыре раза, и замораживание будет производиться на сухом льду. После замораживания клеточные гранулы помещают на водяную баню при температуре 37 градусов, чтобы разморозить их, а затем они снова замораживаются на сухих глазах между каждым этапом замораживания. Теперь мы собираем вируссодержащую надосадочную жидкость и добавляем ее к надосадочной жидкости от предыдущего центрифугирования, которая также содержит вирусные частицы.

Этот вирусный препарат теперь готов к смешиванию с равным количеством цельной человеческой крови и сыворотки. Здесь мы объединили препарат вируса с цельной человеческой кровью с добавлением 15% человеческой сыворотки. Этот раствор вируса крови теперь будет использоваться для кормления комаров и их заражения.

Мы собираемся добавить эту кровь в мембранную кормушку, и эта мембранная кормушка будет помещена на чашку с комарами, и мы дадим комарам питаться этой кровью около 25 минут. Мы поместили зажим на мембранный питатель для того, чтобы стабилизировать его. Он утяжеляет его в основном на сетке, и теперь мы добавим кровь в кормушку.

В некоторых случаях этот эксперимент может быть более эффективным, когда он проводится в темноте, поскольку естественно комары часто питаются в темноте. Это, конечно, зависит от того, как была подготовлена колония комаров. Комары питаются уже около 25-30 минут, и мы можем снять мембранную кормушку и поместить ее в безопасный контейнер для обеззараживания.

После сдачи крови негодные комары должны быть удалены из комаров ФРС. Для этого мы сбивали комаров, помещая маленькие стаканчики с комарами, которых кормили кровью, в холодное помещение на 5-10 минут. Как мы видим, комары уже опустились на мороз.

Открываем крышку и переносим комаров в маленькую кастрюлю для бензина, которая держится на ведре со льдом, чтобы комары все время держались в холоде и не могли убежать. Помните, что это инфицированные комары, поэтому необходимо соблюдать все меры предосторожности, чтобы не дать им вырваться на свободу. Как только комары опускаются в холодную комнату, которые переносят комаров в обычный инсектор, который поддерживается при комнатной температуре, но мы всегда помещаем комаров в петромиску, которая хранится в ведре со льдом, чтобы они всегда были там, так что они всегда внизу.

Вы можете увидеть, как можно убрать комаров ФРС от комаров UNFI. У сытых кровь в них. Они полностью набухают.

Некоторые из них частично питаются кровью, поэтому они не полностью набухают. У них в животе немного крови, но у других в животе много крови. У тех, кто не имеет крови, в животе нет крови, поэтому вы можете легко, легко отличить ФРС от непригодных.

Итак, мы перенесем этих комаров из тарелки для бензина в картонные стаканчики для восковой линии. Следующим шагом является анализ на вирусную инфекцию денге у комара. Если мы хотим проанализировать вирусную инфекцию в средней кишке комара, мы должны препарировать комаров примерно на седьмой день после того, как они приняли кровяную пищу.

И если вы хотите проанализировать вирусную инфекцию в салиевой железе, мы должны препарировать комаров примерно через 14 дней после кормления кровью, Хосе теперь покажет вам, как отделить кишечник комара. Комары теперь обезболены на льду, и мы убьем их с помощью инкубации в 70% этаноле в течение примерно одной минуты. Далее переносим комаров на две последовательные водяные ванны.

По одной минуте каждому. Это нужно для того, чтобы смыть этанол с комаров. Теперь мы будем препарировать комаров в PBS на предметных стеклах микроскопа.

Лучший способ отделить среднюю кишку от комара — это положить комара вверх ногами на крылья и захватить брюшную часть одним щипцом и грудную клетку другим щипцом, а затем потянуть комара. Теперь Хосе раздвигает комара на части, и кишечник появится между брюшной полостью и грудной частью комара. Теперь кишечник – это полупрозрачная ткань, которая появилась на верхней части комара.

Теперь мы перенесем расчлененный кишечник в среду клеточной линии и привезем его в колпак для культуры тканей, чтобы изолировать частицы вируса из кишечника. Мы переносим рассеченные средние кишки в комнату для культивирования тканей и гомогенизируем пестиком, чтобы высвободить вирусные частицы. После гомогенизации средней кишки мы добавляем среду к гомогенату для достижения разбавления вирусных частиц от 1 до 100.

Затем продолжаем разбавлять это до одного к 10, от одного до 101 до 1000. В 96-луночной пластине мы подготовили клеточную линию Alba picto до 80% текучести в 24-луночной пластине. Затем мы удаляем суп из клеток hiatus alba picto и к этим клеткам добавляем разбавленные вирусные частицы, чтобы определить концентрацию вирусных частиц в каждом разведении.

Это позволит нам определить уровень заражения вирусом. В средней кишке комара клетки медленно встряхивают в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем помещаем клетки на 45 минут в инкубатор с температурой 37 градусов CO2.

Затем мы добавляем по одному мл 1%-ного слоя метилцеллюлозы в каждую лунку, а затем планшет снова инкубируется при 37 градусах CO2 в инкубаторе в течение пяти дней. После пятидневной инкубации мы добавляем по одному мл фиксатора метанола ацетона в каждую лунку. Затем инкубируем тарелку при температуре четыре градуса Цельсия в холодильнике в течение одного часа.

Далее снимаем фиксатор и промываем каждую лунку по одному разу PBS. Затем мы проводим разведение первичных антител против денге в 5% растворе крови в соотношении один к 1000. Далее добавляем 200 микролитров этого раствора антител.

К каждому, ну и поверните голову. Спасибо. Далее инкубируем пластину в течение одного часа при температуре 37 градусов по Цельсию. Далее мы удаляем гипериммунную жидкость и промываем каждую лунку одним XPBS.

Далее повторяем процедуру точно таким же образом с вторичным антителом. У нас готовится 20 мл субстрата согласно протоколу, и мы добавляем его в емкость. Затем в каждую лунку добавляем по 200 микролитров субстрата.

Далее останавливаем реакцию, удаляя субстрат, и добавляем по одному мл дистиллированной воды в каждую лунку. Затем сбрасываем воду с тарелки и даем тарелке высохнуть. Каждая цветная точка представляет собой бляшку вируса, и, подсчитывая эти бляшки, мы можем оценить количество вирусных частиц, которые были в исходной средней кишке комара, которого мы гомогенизировали.

Мы только что показали вам Процедуру проведения инфекции вирусом денге у комаров aegypti. Этот протокол предполагает выработку вируса в клеточной линии комаров. Затем вирусные частицы очищаются из клеточной линии и изолируются, а затем смешиваются с цельной кровью человека и скармливаются комарам.

Вирус заражает комаров, и как только инфекция будет установлена, мы покажем вам, как изолировать ткань средней кишки комара и как определить уровень инфекции этой средней кишки. По сути, мы гомогенизируем среднюю кишку и используем эту процедуру для высвобождения вирусных частиц из этой средней кишки. Затем мы используем эти вирусные частицы для повторного заражения клеточной линии комаров, чтобы определить уровень инфекции средней кишки, количество вирусных частиц, которые заразили кишечник комара.