Microfabricated платформы для механическим динамическим культуре клеток

Общая цель следующего эксперимента заключается в микрофабрикации устройств, используемых для механической стимуляции клеток в двух- и трехмерных культуральных средах. Это достигается путем использования метода многослойного сэндвич-формования и стекирования для создания массива вертикально перемещаемых микростолбиков. На втором этапе массив вертикально перемещаемых микростолбиков модифицируется для растяжения культуральной пленки, что позволяет прикладывать точно контролируемые деформации к клеткам, культивируемым на этой пленке.

В качестве альтернативы массив может быть модифицирован для сжатия микроструктурированных конструкций из биоматериалов с целью приложения механической стимуляции к клеткам. При культивировании в массиве трехмерных гидрогелей, на основании анализа изображений флуоресцентных реперных маркеров, были получены результаты, демонстрирующие одновременное приложение диапазона двумерных эхо-биаксиальных и трехмерных деформаций сжатия по всему массиву. Здравствуйте, я Крис Марияс из лабораторий Крейга Симмонса и Ю Сун с кафедры машиностроения и промышленного проектирования, а также Института биоматериалов и биомедицинской инженерии Университета Торонто.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру изготовления микроустройств, используемых для механической стимуляции клеток. В нашей лаборатории мы применяем этот метод для изучения того, как клетки реагируют на различные механические воздействия в культуре in vitro. Итак, приступим.

Процесс изготовления сэндвич-формы включает наложение прозрачной пленки на неотвержденный полидиметилсилоксан (PDMS) на мастер-форме из SU-8. Сэндвич помещают в стопку из вспененного стекла и металла и отверждают в печи под давлением. В завершение стопку разбирают, а прозрачную пленку отделяют, сохраняя структурированный слой PDMS.

Для начала этого процесса тщательно перемешайте PDMS, мономер и сшивающий агент. Используя стандартное соотношение 10:1, нанесите три миллилитра незатвердевшей смеси PDMS на предварительно изготовленную мастер-форму из SU-8 и подвергните полимер дегазации в вакуумной камере. Затем поместите поролоновую прокладку и мастер-форму из SU-8 на основание из плексигласа.

Осторожно опустите гладкую сторону прозрачной пленки для струйной печати на неотвержденный PDMS, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Затем поместите силилизированное предметное стекло поверх пленки под вторую поролоновую прокладку и верхнюю пластину из плексигласа. Зажмите всю конструкцию с помощью С-образной струбцины.

Отверждайте «сэндвич» из PDMS в печи при 80 °C в течение не менее четырех часов. После завершения отверждения извлеките «сэндвич» из печи и дайте ему остыть. После охлаждения снимите зажим и разберите конструкцию.

Осторожно отделите прозрачную пленку от мастер-формы SU-8, сохранив при этом паттернированную пленку из PDMS. Обрежьте края пленки с паттерном, чтобы удалить излишки PDMS, и храните слои с паттерном в безпылевой среде до начала использования. Следующая часть данного протокола посвящена созданию микроfabricated массива вертикально приводимых в движение столбиков.

Для создания массива микростолбиков требуется многослойный процесс изготовления. Самый нижний структурированный слой PDMS подготавливается методом изготовления формы-сэндвича. В данных экспериментах использовались круглые структуры с диаметром от 600 до 1 200 микрон.

Для переноса слоя PDMS на чистый предметное стекло используйте установку коронного разряда для обработки поверхностей PDMS и стекла кислородной плазмой. Затем приведите две поверхности в контакт друг с другом. Поместите полученную конструкцию на нагревательную плитку при температуре 80 °C на 10 минут для завершения процесса склеивания.

Отделите прозрачную пленку и утилизируйте ее. Этот процесс гарантирует, что структурированная пленка из PDMS никогда не отделяется от жесткой подложки, что предотвращает усадку отдельных слоев. Второй слой сэндвич-формы создается как негативная реплика-матрица желаемой структуры диафрагмы и столбиков.

В данной демонстрации для формирования этого слоя использовались круглые стойки диаметром 500 микрон. Сначала временно закрепите форму с негативным рельефом на предметном стекле с помощью двухстороннего скотча и силиконизируйте ее в вакуумном эксикаторе; нанесите неотвержденный PDMS на этот «сэндвич» из формы и слоя, удалите пузырьки газа и проведите центрифугирование в течение 45 секунд при 1000 об/мин, чтобы получить приводную диафрагму толщиной 60 микрон; частично отвердите нанесенный методом центрифугирования слой PDMS при 80 °C в течение примерно 20 минут или до тех пор, пока PDMS не станет липким, но перестанет необратимо деформироваться при касании; удалите предметное стекло и двухсторонний скотч из частично отвержденного слоя PDMS и прозрачной пленки, закрепите его на паре предметных стекол для манипуляций и подвергните воздействию плазмы.

Обработайте частично отвержденный PDMS, затем переверните его и поместите в специально изготовленный выравниватель. Выравниватель состоит из вакуумного зажима, установленного на микроманипуляторе. Далее подвергните первый слой PDMS плазменной обработке, затем поместите его на поворотный стол под вакуумным зажимом.

Проверьте совмещение двух слоев с помощью системы машинного зрения Avatar с 12-кратным увеличением. Используя манипулятор, совместите слои и осторожно приведите их в соприкосновение. Слегка прижмите слои пальцем, чтобы они зафиксировались друг с другом.

Затем извлеките «сэндвич» из устройства для выравнивания. Удалите стеклянные предметные стекла, используемые для перемещения, и убедитесь, что слои плотно прилегают друг к другу. Проведите отверждение в печи при 80 °C в течение дополнительных 30 минут.

Через 30 минут прозрачную силиконизированную реплику формы из PDMS можно отделить от устройства и утилизировать. Затем устройство подвергают полному отверждению при 80 °C в течение как минимум четырех часов, чтобы проводить эксперименты с клетками, культивируемыми на деформируемом двухмерном субстрате. Массив микроактуаторов модифицируют путем прикрепления третьего слоя PDMS к устройству.

Третий слой PDMS представляет собой двухслойную структуру. Нижний круг соответствует размеру приводной полости под приводимыми микростолбиками. Диаметр верхнего круга на 100 микрон больше диаметра загрузочных столбиков.

Микроканал шириной 200 micron соединяет эти элементы с областью подключения и будет использоваться для смазки загрузочных столбиков и культуральной пленки. Чтобы модифицировать устройство для 2D-культивирования, сначала изготовьте коннекторы и прикрепите их к устройству, как описано в письменном протоколе. Затем нанесите методом центрифугирования слой PDMS толщиной от 10 to 15 micron на гладкую сторону прозрачной пленки и отвердите его.

Тонкую пленку из PDMS выдерживают при 80 °C в течение не менее четырех часов. Следующий шаг заключается в создании вакуума в актуаторах и приклеивании слоя PDMS к устройству. Для этого.

Сначала создайте слабый вакуум в актуаторах, чтобы опустить массив столбиков для плазменной обработки и склеивания. Нанесите методом центрифугирования пленку PDMS на актуаторное микроустройство, как описано в письменном протоколе; столбики и культуральная пленка будут оставаться гидрофильными в течение короткого времени. Затем подключите шприц с лубрикантом к устройству и заполните каналы смазки 90% раствором глицерина в деионизированной воде.

Помимо смазки, данный состав обеспечивает неограниченное сохранение гидрофильности PDMS, что снижает коэффициенты трения. Поместите устройство на нагревательную плитку при 40 °C и продолжайте вводить смазочный материал в канал, создавая небольшое повышение давления. Через несколько минут пузырьки воздуха диффундируют через PDMS, и все поверхности будут смазаны.

На заключительном этапе снимите отрицательное давление и освободите столбики с помощью скальпеля. Вырежьте контур вокруг тонкой пленки PDMS. Осторожно отделите прозрачную подложку от области плазменного соединения устройства.

Прокладка из PDMS, вырезанная вручную по периметру области культивирования устройства. Стерилизуйте устройство, погрузив его в 70% ethanol на пять минут, после чего обработайте его бактерицидным УФ-излучением в боксе биологической безопасности в течение 45 минут. Обработайте поверхность плазмой и инкубируйте с коллагеном в концентрации 100 µg/mL в течение ночи при температуре 4 °C.

После инкубации в течение ночи промойте устройство стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и проведите посев клеток с плотностью от 10 до 15 000 клеток на квадратный сантиметр. В соответствии со стандартными протоколами культивирования клеток, массив микроактуаторов может быть модифицирован для проведения экспериментов с клетками, культивируемыми в трехмерных фотопаттернированных гидрогелевых конструкциях. Сначала изготавливается многослойная платформа на основе PDMS.

После покрытия базовой платформы соответствующим раствором предшественника гидрогеля на стеклянную покровную пластинку, в матрицу вводится фотополимеризуемый резервный биоматериал, после чего остатки раствора предшественника вымываются. Полученную матрицу из вертикально перемещаемых нагрузочных стоек можно использовать для приложения сжимающих механических сил к клеткам, культивируемым в трехмерных биоматериалах; при этом области вокруг стоек маскируются кусочками клейкой ленты, а устройство покрывают Parylene C в системе PDS 2010 LabCOATER-2.

Это улучшит кинетику полимеризации для данной системы биоматериалов. После нанесения покрытия извлеките устройство из системы нанесения и отделите клейкую ленту, оставив конформный слой парилена C на стойках. Затем проведите метилирование покровного стекла ACRL путем погружения в 2% (об./об.) раствор триметоксипропилметакрилата в 95% этаноле на две минуты.

Промойте покровное стекло. Погрузите его в 100% ethanol, после чего подвергните нагреву при 100 °C, чтобы на поверхности остались метакрилатные группы. Сформируйте проставку из PDMS толщиной 200 micron.

Поместите пленку в чашку Петри и разрежьте ее на небольшие фрагменты. С помощью плазменной бондинга закрепите четыре таких фрагмента по краям покровного стекла, связанного с meac. Затем при помощи плазменного бондинга закрепите эти промежутки в областях PDMS устройства, покрытых Lene C.

В завершение стерилизуйте устройство, промыв его в 70% ethanol, и подвергните воздействию гермицида или УФ-излучения в шкафу биологической безопасности в течение 45 минут. Для фотолитографического формирования структуры ПЭГ-гидрогелей с клетками внутри устройств приготовьте растворы прекурсора и фотоинициатора согласно письменному протоколу и тщательно перемешайте их для получения раствора с концентрацией фотоинициатора 0,4% вес/объем.

Профильтруйте смесь через шприцевой фильтр с порами 0,45 micron для стерилизации и удаления твердых частиц, трипсинизируйте клеточные культуры и приготовьте клеточную суспензию в культуральной среде с концентрацией клеток, в два раза превышающей целевую конечную концентрацию. Затем смешайте клеточную суспензию и профильтрованный раствор прекурсора гидрогеля с фотоинициатором в соотношении один к одному. Введите раствор в микроустройство, используя длинную иглу калибра 25 gauge.

Осторожно избегайте образования пузырьков воздуха в устройстве. Совместите распечатанную маску на прозрачной пленке с метками совмещения на поверхности устройства. Настройте систему УФ-освещения так, чтобы обеспечить дозу УФ-излучения с длиной волны 365 nanometer мощностью 17.5 milliwatt per square centimeter на поверхности устройства.

Освещайте гидрогель через маску в течение 195 секунд после начала облучения. Смойте неполимеризованный раствор предшественника гидрогеля с помощью PBS и замените PBS на культурную среду, затем задействуйте загрузочные стойки для сжатия конструктов из гидрогеля. Здесь показано готовое устройство для 2D-механостимулирующего культивирования.

Красный краситель используется для маркировки каналов подачи рабочего давления, а синий — для маркировки каналов смазки при определении характеристик деформации. Эксперименты могут быть использованы для определения полей приложенной деформации путем отслеживания перемещения флуоресцентных микросфер на подложках. Красные точки обозначают исходное положение микросфер, а зеленые — их положение после деформации.

Образец устройства для трехмерных экспериментов по сжатию представлен здесь; зеленый краситель используется для маркировки каналов давления активации. Вид сверху на массив микростолбиков демонстрирует гидрогелевую конструкцию, сформированную поверх столбиков, а рядом представлены реконструированные изображения флуоресцентных бусин в гидрогелевой конструкции. Состояния покоя и давления активации 55 kPa демонстрируют процесс характеризации деформации в трехмерной системе культивирования.

Таким образом, мы продемонстрировали способ изготовления устройств, используемых для механической стимуляции клеток в двух- или трехмерных культуральных системах. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать максимальную чистоту устройств, избегая попадания пыли, а также проявлять терпение, особенно на этапах совмещения. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем удачи в ваших экспериментах.