Microfabricated платформы для механическим динамическим культуре клеток

Общая цель следующего эксперимента заключается в микрофабрикации устройств, используемых для механической стимуляции клеток в двух- и трехмерных культуральных средах. Это достигается с помощью метода многослойного сэндвич-формования и штабелирования для создания массива вертикально приводимых микростолбиков. На втором этапе массив вертикально приводимых микростолбиков модифицируется для растяжения культуральной пленки, что позволяет прикладывать точно контролируемые деформации к клеткам, культивируемым на этой пленке.

В качестве альтернативы массив может быть модифицирован для сжатия микроструктурированных конструкций из биоматериалов с целью приложения механической стимуляции к клеткам. При культивировании в массиве трехмерных гидрогелей на основе анализа изображений флуоресцентных реперных маркеров были получены результаты, демонстрирующие одновременное приложение диапазона двумерных эхо-биаксиальных и трехмерных деформаций сжатия по всему массиву. Здравствуйте, я Крис Марияс из лабораторий Крейга Симмонса и Ю Сун с кафедры машиностроения и промышленного инжиниринга, а также из Института биоматериалов и биомедицинской инженерии Университета Торонто.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру изготовления микроустройств, используемых для механической стимуляции клеток. В нашей лаборатории мы применяем этот метод для изучения того, как клетки реагируют на различные механические воздействия в культуре in vitro. Итак, приступим.

Процесс изготовления сэндвич-формы включает наложение прозрачной пленки на незатвердевший полидиметилсилоксан (PDMS) на мастер-матрице из SU-8. Сэндвич помещают в стопку из вспененного стекла и металла и подвергают отверждению в печи под давлением. В завершение стопку разбирают, а пленку отделяют, сохраняя структурированный слой PDMS.

Для начала этого процесса тщательно перемешайте ПДМС, мономер и сшивающий агент. При стандартном соотношении 10:1 нанесите 3 mL несшитой смеси ПДМС на предварительно изготовленную мастер-форму из SU-8 и подвергните полимер дегазации в вакуумной камере. Затем поместите поролоновую прокладку и мастер-форму из SU-8 на основание из плексигласа.

Осторожно опустите гладкую сторону прозрачной пленки для струйного принтера на незатвердевший PDMS, стараясь не допустить образования пузырьков воздуха. Затем поместите силилизированное предметное стекло поверх пленки под вторую пенную прокладку и верхнюю пластину из плексигласа. Зажмите полученный «сэндвич» с помощью C-образной струбцины.

Отверждайте «сэндвич» из PDMS в печи при 80 °C в течение не менее четырех часов. После отверждения извлеките «сэндвич» из печи и дайте ему остыть. После охлаждения снимите зажим и разберите «сэндвич».

Осторожно отделите прозрачную пленку от мастер-формы SU-8, сохранив при этом паттернированную пленку PDMS. Обрежьте края пленки с паттерном, чтобы удалить излишки PDMS, и храните слои с паттерном в безпылевой среде до их использования. Следующая часть данного протокола посвящена созданию микрофабрикованного массива вертикально приводимых столбиков.

Для создания массива микростолбиков требуется многослойный процесс изготовления. Нижний структурированный слой PDMS подготавливается методом изготовления сэндвич-формы. В данных экспериментах использовались круглые структуры диаметром от 600 до 1 200 микрон.

Чтобы перенести слой PDMS на чистый предметное стекло, используйте установку коронного разряда для обработки поверхностей PDMS и стекла кислородной плазмой. Затем приведите две поверхности в контакт друг с другом. Поместите полученный стек на нагревательную плитку при температуре 80 °C на 10 минут для завершения процесса склеивания.

Отделите прозрачную пленку и утилизируйте ее. Этот процесс гарантирует, что структурированная пленка из PDMS никогда не отделяется от жесткой подложки, что предотвращает усадку отдельных слоев. Второй слой сэндвич-формы создается как негативный репликационный шаблон желаемой структуры диафрагмы и столбиков.

В данной демонстрации для формирования этого слоя использовались круглые стойки диаметром 500 microns. Сначала временно закрепите форму негативного реплика на предметном стекле с помощью двустороннего скотча и силиконизируйте в вакуумном эксикаторе; нанесите незатвердевший PDMS на «сэндвич» из формы и слоя; удалите пузырьки газа и проведите центрифугирование в течение 45 seconds при 1000 rotations per minute, чтобы получить приводную диафрагму толщиной 60 microns; частично отвердите центрифугированный слой PDMS при 80 °C в течение приблизительно 20 minutes или до тех пор, пока PDMS не станет липким, но перестанет необратимо деформироваться при прикосновении; удалите предметное стекло и двусторонний скотч из частично отвержденного слоя PDMS и прозрачной пленки, закрепите его на паре стеклянных манипуляционных предметных стекол и подвергните воздействию плазмы.

Обработайте частично отвержденный PDMS, затем переверните его и поместите в специально изготовленный выравниватель. Выравниватель состоит из вакуумного прижима, установленного на микроманипуляторе. Далее подвергните первый слой PDMS плазменной обработке, после чего поместите его на поворотный стол под вакуумным прижимом.

Проверьте совмещение двух слоев с помощью системы машинного зрения Avatar с 12-кратным увеличением. Используя манипулятор, совместите слои и осторожно приведите их в соприкосновение. Слегка прижмите слои пальцем, чтобы зафиксировать их друг с другом.

Затем извлеките «сэндвич» из устройства для выравнивания. Уберите стеклянные предметные стекла и убедитесь, что слои полностью плотно прилегают друг к другу. Проведите отверждение в печи при 80 °C в течение дополнительных 30 минут.

По истечении 30 минут прозрачную силиконизированную реплику формы из PDMS можно отделить от устройства и утилизировать. Затем устройство подвергают полному отверждению при 80 °C в течение не менее четырех часов для проведения экспериментов с клетками, культивируемыми на деформируемом двумерном субстрате. Массив микроактуаторов модифицируют путем приклеивания к устройству третьего слоя PDMS.

Третий слой ПДМС представляет собой двухслойную структуру. Нижний круг соответствует размеру приводной полости под приводимыми микростолбиками. Диаметр верхнего круга на 100 микрон больше диаметра загрузочных столбиков.

Микроканал шириной 200 микрон соединяет эти элементы с областью подключения и будет использоваться для смазки загрузочных столбиков и культуральной пленки. Чтобы модифицировать устройство для 2D-культивирования, сначала изготовьте коннекторы и прикрепите их к устройству, как описано в письменном протоколе. Затем нанесите методом центрифугирования слой PDMS толщиной от 10 до 15 микрон на гладкую сторону прозрачной пленки и проведите отверждение.

Тонкую пленку из PDMS выдерживают при 80 °C в течение не менее четырех часов. Следующим шагом является создание вакуума в актуаторах и прикрепление слоя PDMS к устройству. Для достижения этого.

Сначала создайте низкий вакуум в приводах, чтобы опустить массив столбиков для плазменной обработки и склейки. Нанесите методом центрифугирования пленку PDMS на микроустройство с приводами, как описано в письменном протоколе; столбики и культуральная пленка будут оставаться гидрофильными в течение короткого времени. Затем подсоедините шприц с лубрикантом к устройству и заполните смазочные каналы 90% раствором глицерина в деионизированной воде.

Помимо смазки, данный состав обеспечивает неограниченное сохранение гидрофильности PDMS, снижая коэффициенты трения. Поместите устройство на нагревательную плитку при температуре 40 °C и продолжайте вводить смазку в канал, создавая небольшое повышение давления. Через несколько минут пузырьки воздуха диффундируют через PDMS, и все поверхности будут смазаны.

На заключительном этапе снимите отрицательное давление, высвободив стойки с помощью скальпеля. Вырежьте область вокруг тонкой пленки PDMS. Осторожно отделите прозрачную подложку от плазменного соединения устройства.

Прокладка из PDMS, вырезанная вручную по периметру области культивирования устройства. Стерилизуйте устройство, погрузив его в 70% ethanol на пять минут, после чего подвергните воздействию бактерицидного УФ-излучения в шкафу биологической безопасности в течение 45 минут. Обработайте поверхность плазмой и инкубируйте с коллагеном в концентрации 100 µg/mL в течение ночи при температуре 4 °C.

После инкубации в течение ночи промойте устройство стерильным фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и проведите посев клеток с плотностью от 10 до 15 000 клеток на квадратный сантиметр. В соответствии со стандартными протоколами культивирования клеток, массив микроактуаторов может быть модифицирован для проведения экспериментов с клетками, культивируемыми в трехмерных фотолитографических гидрогелевых конструктах. Сначала изготавливается многослойная платформа на основе PDMS.

После покрытия базовой платформы соответствующим раствором предшественника гидрогеля на предметное стекло в массив впрыскивается фотополимеризуемый биоматериал, после чего остатки раствора предшественника вымываются. Полученный массив вертикально перемещаемых нагрузочных стоек можно использовать для приложения сжимающих механических сил к клеткам, культивируемым в трехмерных биоматериалах; при этом области вокруг стоек маскируются кусочками клейкой ленты, а затем устройство покрывают париленом C в системе PDS 2010 lab COTER two.

Это улучшит кинетику полимеризации для системы биоматериала. После нанесения покрытия извлеките устройство из системы нанесения и снимите клейкую ленту, оставив конформный слой парилена C на стойках. Затем подвергните покровное стекло ACRL метилированию путем погружения в 2% (об/об) раствор триметоксипропилметакрилата в 95% этаноле на две минуты.

Промойте покровное стекло. Погрузите его в 100% ethanol, после чего подвергните термической обработке при 100 °C, чтобы на поверхности остались метакрилатные группы. Отлейте разделитель из PDMS толщиной 200 micron.

Поместите пленку в чашку Петри и разрежьте ее на небольшие фрагменты. С помощью плазменной сварки закрепите четыре таких фрагмента по краю покровного стекла, связанного с meac. Затем плазменным методом закрепите промежутки с областями PDMS устройства, перекрывая покрытие Lene C.

Наконец, стерилизуйте устройство путем промывки в 70% ethanol и экспозиции под действием гермицида или УФ-излучения в шкафу биологической безопасности в течение 45 минут. Для фотолитографического формирования паттерна ПЭГ-гидрогелей с включением клеток в устройства подготовьте растворы прекурсора и фотоинициатора согласно письменному протоколу и тщательно перемешайте их для получения раствора с концентрацией фотоинициатора 0.4% вес/объем.

Профильтруйте смесь через шприцевой фильтр с порами 0,45 мкм для стерилизации и удаления твердых частиц, трипсинизируйте культуры клеток и приготовьте клеточную суспензию в культуральной среде с концентрацией клеток, в два раза превышающей целевую конечную концентрацию. Затем смешайте клеточную суспензию и профильтрованный раствор фотоинициатора предшественника гидрогеля в соотношении один к одному. Введите раствор в микроустройство с помощью длинной иглы 25-го калибра.

Осторожно следите за тем, чтобы в устройстве не оставалось пузырьков воздуха. Совместите напечатанную прозрачную маску с метками совмещения на поверхности устройства. Настройте систему УФ-освещения таким образом, чтобы обеспечить дозу УФ-излучения с длиной волны 365 nanometer мощностью 17.5 milliwatt per square centimeter на поверхности устройства.

Освещайте гидрогель через маску в течение 195 секунд после начала облучения. Смойте неполимеризованный раствор предшественника гидрогеля с помощью PBS и замените PBS на культуральную среду; задействуйте фиксирующие стойки для сжатия конструкций из гидрогеля. Здесь показано готовое образец-устройство для 2D-механостимулирующего культивирования.

Красный краситель используется для маркировки каналов подачи приводного давления, а синий краситель D — для маркировки каналов смазки при определении характеристик деформации. Эксперименты могут быть использованы для определения полей приложенной деформации путем отслеживания перемещения флуоресцентных микросфер на подложках. Красные точки обозначают исходное положение микросфер, а зеленые точки — их положение после деформации.

Здесь представлено устройство для проведения экспериментов по трехмерному сжатию, в котором зеленый краситель используется для маркировки каналов давления активации. Вид сверху на массив микростолбиков демонстрирует гидрогелевую конструкцию, сформированную поверх них; на изображениях сбоку показана реконструкция флуоресцентных микросфер в гидрогелевой конструкции. Состояния покоя и давления активации 55 kPa демонстрируют процесс характеристики деформации в системе трехмерного культивирования.

Итак, мы только что продемонстрировали вам, как изготовить устройства, используемые для механической стимуляции клеток в двух- или трехмерных культуральных системах. При выполнении данной процедуры важно помнить о необходимости поддерживать максимальную чистоту устройств, избегать попадания пыли и проявлять терпение, особенно на этапах совмещения. На этом всё.

Благодарим за просмотр и желаем успехов в ваших экспериментах.