Применение NMDA-рецепторов в проводимости мозга крысы дофаминергических нейронов с помощью динамического Техника Clamp
21 декабря 2010 г.
В этом видео показано, как применять проводимости в дофаминергических нейронов, записанные в целом конфигурации клетки в срезах мозга крыс. Эта техника называется динамическим зажимом.
Нейробиологи изучают функции мозга, исследуя способы взаимодействия нейронов. В данной работе изменения электрической активности одного нейрона вызывают путем подачи экспериментально контролируемого тока с использованием метода динамического зажима. Сначала изготавливают тонкие срезы мозга, которые хранят в инкубационной камере, заполненной искусственной спинномозговой жидкостью.
Затем срез переносят на установку для патч-кламп регистрации. Выбирают нейрон и фиксируют его записывающим электродом с помощью компьютера динамического зажима, подключенного к регистрирующему усилителю. В клетку подают проводимость NMDA-рецептора.
Полученные записи демонстрируют серию потенциалов действия, что указывает на то, что активация NMDA-рецепторов является одним из клеточных механизмов, с помощью которых дофаминергические нейроны могут генерировать пачки импульсов. Основным преимуществом данного метода по сравнению с существующими подходами, такими как инъекция постоянного тока или фармакологическое воздействие, является возможность точно определить влияние активации экспериментально определенного рецептора на электрическую активность живого нейрона. После быстрого извлечения мозга у крысы линии Bragg dolly, находящейся под наркозом, с помощью вибротома были изготовлены горизонтальные срезы мозга толщиной 240 micrometer.
По мере нарезания срезов с помощью переносной пипетки помещайте их в инкубационную камеру с температурой 32 °C, заполненную искусственной спинномозговой жидкостью, до начала проведения экспериментов по регистрации. Установка для внутриклеточной регистрации состоит из микроскопа с объективами, настроенными для визуализации с градиентным контрастом, монитора, системы перфузии, усилителя Multi Clamp 700 B, аналого-цифрового преобразователя, микроманипулятора и головки микроэлектрода. На компьютере Mac Pro установлено программное обеспечение для сбора данных Axo Graph X и Multi Clamp Commander. Рядом с установкой для внутриклеточной регистрации и компьютером Mac Pro расположен компьютер Sun Microsystems под управлением операционной системы Linux реального времени со своим аналого-цифровым преобразователем, который будет использоваться в методе динамического зажима (dynamic clamp).
Установка для внутриклеточной регистрации должна обеспечивать перфузию искусственной спинномозговой жидкости при температуре примерно 35 °C. Если срез для регистрации был подготовлен горизонтально, используйте переносную пипетку, чтобы поместить его в чашку Петри с искусственной спинномозговой жидкостью, и с помощью режущего инструмента разделите срез пополам по срединной линии. Затем, для проведения электрофизиологических записей, перенесите срез пипеткой в установку для внутриклеточной регистрации.
Используя объектив 40х, визуализируйте целевой нейрон; здесь виден отдельный дофаминергический нейрон черной субстанции. Обратите внимание на сому эллиптической формы с двумя отходящими дендритами. С помощью электронного пуллера микропипеток P 97 вытяните электроды с сопротивлением кончика от 4 до 10 МОм.
Затем с помощью иглы микрошприца заполните электрод внутренним раствором. Вставьте заполненный электрод в полуячейку, подключенную к головному блоку усилителя, используя шприц, соединенный с полуячейкой коротким отрезком трубки. Создайте небольшое положительное давление в регистрирующем электроде.
Под визуальным контролем опустите электрод на целевой нейрон. На поверхности клетки появится небольшое углубление. Создайте небольшое отрицательное давление для формирования гигаомного контакта (giga seal) с выбранным нейроном.
Примените вакуум (всасывание ртом), чтобы разорвать герметичное соединение. Это представляет собой запись от всей клетки. После разрыва соединения используйте программный интерфейс Multi Clamp Commander, чтобы перевести усилитель в режим фиксации тока (current clamp), при котором инъекция тока невозможна.
Чтобы применить проводимость NMDA к этой клетке, начните с запуска программного обеспечения RTXI на компьютере с динамическим зажимом. Затем загрузите в память специально написанную модель, содержащую рецептор NMDA. После загрузки модели в память RTX я буду в режиме реального времени рассчитывать ток, который необходимо ввести в клетку, используя приведенное здесь уравнение, где G-N-M-D-A — это желаемая проводимость в nS, установленная на уровне ноль nS.
В программе Semens по умолчанию MG означает концентрацию магния. E-N-M-D-A — это потенциал реверсии для NMDA-рецептора, установленный на 0 мВ, а VM — мембранный потенциал клетки, измеряемый усилителем в мВ. Теперь с помощью стандартного кабеля BNC соедините выход компьютера динамического зажима с командным входом усилителя через аналого-цифровой преобразователь.
Переведите усилитель в стандартный режим фиксации тока (current clamp) с помощью программного интерфейса Multi Clamp Commander. Система RTXI была настроена для получения заданного значения проводимости GFT из вольтажного сигнала, поступающего из программного обеспечения для сбора данных Axo Graph X. В данном случае мы выполняем простой протокол в Axo Graph X, при котором на клетку подается ступень проводимости величиной 40 nS продолжительностью одну секунду.
С помощью установки, описанной в данном видео, индуцируют серию потенциалов действия в ответ на скачок проводимости; была выполнена регистрация из сомы дофаминергического нейрона компактной части черной субстанции (substantial nire pars compacta) в конфигурации whole-cell. Дофаминергические клетки обычно демонстрируют спонтанную активность с низкой частотой по типу пейсмейкера. Серию потенциалов действия можно вызвать фазическим приложением проводимости NMDA-рецептора с помощью динамического зажима.
После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как применить кондуктанс NMDA к живому дофаминергическому нейрону в изолированном срезе мозга. Однако этот метод может быть использован для любого типа клеток, запись с которых возможна с помощью стандартных электрофизиологических методов. Аналогично, динамический зажим может быть расширен для имитации электрических эффектов широкого спектра типов рецепторов.
Мы надеемся, что это видео помогло наглядно продемонстрировать суть метода динамического зажима и то, как мы применяем его в нашей лаборатории. Спасибо за просмотр.
Обзор
В данном видео демонстрируется способ введения проводимости в дофаминергический нейрон с использованием метода динамического зажима (dynamic clamp) в срезах мозга крысы. Этот метод позволяет осуществлять точный контроль активации рецепторов и её влияния на нейронную активность.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Электрофизиология
- Нейронная коммуникация
Теоретические основы
- Дофаминергические нейроны играют ключевую роль в функционировании мозга.
- Метод динамического зажима расширяет возможности изучения нейронной активности.
- Понимание механизмов активации NMDA-рецепторов имеет жизненно важное значение для нейробиологических исследований.
- Данный метод позволяет манипулировать проводимостью нейронов в режиме реального времени.
Цель исследования
- Продемонстрировать метод динамического зажима (dynamic clamp) на дофаминергических нейронах.
- Исследовать влияние проводимости NMDA-рецепторов на активность нейронов.
- Предоставить практическое руководство для исследователей в области электрофизиологии.
Используемые методы
- Подготовка срезов мозга крысы для регистрации.
- Использование установки для патч-кламп регистрации для доступа к нейронам.
- Применение проводимости NMDA с помощью программного обеспечения динамического зажима.
- Мониторинг потенциалов действия нейронов в режиме реального времени.
Основные результаты
- Применение проводимости NMDA вызывало пачки потенциалов действия.
- Продемонстрирована эффективность метода динамического зажима.
- Получены новые данные о роли NMDA-рецепторов в дофаминергических нейронах.
- Показано, что данный метод может быть применен к различным типам клеток.
Выводы
- Метод динамического зажима (dynamic clamp) является мощным инструментом для изучения нейронной активности.
- Он позволяет точно контролировать активацию рецепторов в живых нейронах.
- Данный метод может расширить наше понимание механизмов нейронного взаимодействия.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Технология динамического зажима позволяет осуществлять точное моделирование рецепторной проводимости в живых нейронах в режиме реального времени, что напрямую способствует снижению механистических рисков и валидации мишеней на ранних этапах разработки нейрофармакологических препаратов. Обеспечивая контролируемое исследование функции NMDA-рецепторов в дофаминергических нейронах, данный подход повышает прогностическую достоверность в критической точке валидации мишени. Адаптивность метода к различным подтипам нейронов делает его универсальным инструментом для портфелей исследований в области нейрофармакологии.
Стратегические приложения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Позволяет проводить прямую проверку гипотез о специфичности рецепторов в нейронных системах, имеющих значение для патологии заболевания.
- Обеспечивает функциональную валидацию мишени путем выделения вклада NMDA-рецепторов в паттерны возбуждения нейронов.
- Способствует механистическому снижению рисков за счет разграничения рецепторных эффектов и неспецифической стимуляции.
- Повышает прогностическую достоверность при разработке нейроактивных соединений, нацеленных на дофаминергические пути.
Скрининг и разработка анализа
- Подготавливает валидированные нейрональные модели для последующих рабочих процессов скрининга соединений.
- Обеспечивает количественное, воспроизводимое измерение пачек потенциалов действия в ответ на определенные ступени проводимости.
- Поддерживает стандартизацию анализа, обеспечивая точный временной и пространственный контроль активации рецепторов.
- Позволяет масштабировать адаптацию к другим типам рецепторов и популяциям нейронов для повторного использования платформы.
Трансляционные и доклинические исследования
- Сопоставляет нейронную активность in vitro с патогенетическими механизмами, вовлеченными в развитие заболеваний ЦНС.
- Обеспечивает преемственность от этапа изучения механизмов до доклинической валидации нейрофармакологических мишеней.
- Позволяет принимать обоснованные решения о дальнейшем продвижении с учетом рисков, уточняя вклад конкретных рецепторов в формирование нейронных фенотипов.
- Способствует разработке трансляционных биомаркеров с помощью количественных электрофизиологических показателей.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Этот метод применяется на этапе перехода от первичного поиска к идентификации ведущих соединений, позволяя проводить проверку гипотез в отношении нейрональных мишеней и обеспечивая поддержку последующего скрининга и трансляционных исследований.
- Биологические исследования: Облегчает проверку гипотез в режиме реального времени и уточнение путей рецепторно-опосредованной нейронной активности.
- Скрининг: Обеспечивает воспроизводимые количественные электрофизиологические данные для оценки соединений.
- Аналитика: Позволяет проводить высокоразрешающие измерения вспышек потенциалов действия и зависимостей между проводимостью и ответом.
- Трансляционные исследования: Связывает механистические открытия с доклиническими моделями заболеваний ЦНС при использовании систем, релевантных конкретному заболеванию.
- Корпоративное использование: Представляет собой гибкую платформу для изучения различных рецепторов и типов клеток в рамках нейробиологических портфелей проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает прогностическую достоверность и снижает механистическую неопределенность при валидации нейрональных мишеней.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию, воспроизводимость и масштабируемость электрофизиологических анализов.
- Стратегическая ценность: Обеспечивает обоснованность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) и эффективность управления капиталом в портфеле НИОКР нейрофармацевтических препаратов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию и продвижение активов, нацеленных на ЦНС, с учетом оценки рисков.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области электрофизиологии методом патч-клампа и навыки работы с программным обеспечением для динамического зажима.
- Необходимо специализированное оборудование, включая аппаратное обеспечение для сбора данных в режиме реального времени и инъекции проводимости.
- Требуется стандартизация протоколов между исследовательскими группами для обеспечения воспроизводимости и сопоставимости данных.
- Метод может быть адаптирован для различных подтипов нейронов и моделей рецепторов при соответствующей настройке программного обеспечения.
- Возможности метода ограничены необходимостью подготовки жизнеспособных срезов мозга и требованием высокого технического мастерства при регистрации токов из всей клетки.
