Аллель-специфичная Анализ экспрессии генов для тестирования функциональной основе генетических ассоциаций

Общая цель следующего эксперимента заключается в том, чтобы проверить, влияет ли определенный вариант ДНК, например, связанный с заболеванием, на экспрессию конкретного гена. Это достигается путем подбора клеточных линий, которые являются гетерозиготными как по данному варианту, так и по кодирующему однонуклеотидному полиморфизму (SNP) в исследуемом гене. На втором этапе из клеток экстрагируют ДНК и РНК, которые затем используются в качестве матрицы для проведения аллель-специфической реакции первичного удлинения.

Затем продукты первичного достройки анализируют методом масс-спектрометрии для количественного определения относительного содержания двух аллелей. Полученные результаты позволяют определить, связан ли исходный вариант ДНК, ассоциированный с заболеванием, также с различием в экспрессии гена на основе количественных аллель-специфических измерений с помощью масс-спектрометрии. Основными преимуществами данного метода являются то, что, в отличие от анализа с использованием репортерного гена люциферазы, он не требует молекулярных манипуляций и позволяет измерять эндогенные уровни экспрессии генов.

Более того, мы можем сравнивать уровни экспрессии двух аллелей с использованием внутреннего контроля, что позволяет устранить часть экспериментальной вариабельности. Этот метод помогает нам ответить на ключевые вопросы в области генетики человека, такие как молекулярные механизмы, лежащие в основе генетических ассоциаций. Идея этого метода возникла у нас, когда мы обнаружили генетическую ассоциацию, охватывающую три гена, и не смогли локализовать сигнал до одного из них.

С помощью дальнейшего генетического картирования. Клетки, используемые для данного анализа, должны экспрессировать интересующий ген, а также соответствовать двум основным генотипическим требованиям. Они должны быть гетерозиготны как по последовательностям ДНК, связанным с заболеванием, так и по маркерам ДНК, которые позволяют различать транскрипты по их хромосомному происхождению. В представленной здесь стратегии отбора клеточных линий линии A и B являются гетерозиготными по транскрибируемому кодирующему маркеру, который обозначен треугольниками.

Однако линия Omnicell A гетерозиготна по последовательности ДНК, связанной с заболеванием, которая называется рисковым вариантом ДНК и обозначена кругами. Синий аллель рискового варианта связан с более низким уровнем транскрипции. После выбора культуры клеточной линии в колбе согласно спецификациям поставщика — в данной демонстрации мы будем использовать фибробласты — подготовьте две чашки Петри диаметром 10 сантиметров для экстракции ДНК и РНК соответственно. Хотя данный анализ в равной степени применим и к другим типам клеток, включая первичные клетки.

Когда клетки достигают 80% конфлюэнтности, их можно собрать для экстракции ДНК и РНК, используя стандартные методы, включая имеющиеся в продаже наборы, подходящие для выбранного типа клеток. Перед проведением данного анализа разработайте две пары ПЦР-праймеров для каждого маркера ДНК: одну пару для амплификации геномной ДНК и другую — для амплификации кДНК. Расположите прямой и обратный праймеры для амплификации кДНК в разных экзонах, чтобы избежать контаминации геномной ДНК. Разработайте праймеры таким образом, чтобы ПЦР-продукт для каждой клеточной линии имел длину от 100 до 500 пар оснований. Подготовьте ПЦР-реакции объемом 8 µL: четыре независимые реакции для амплификации геномной ДНК и четыре независимые реакции для амплификации кДНК в каждом случае.

Смесь для ПЦР-реакции содержит ДНК-матрицу, NTP, праймеры, хлорид магния, а также либо геномную ДНК, либо кДНК. Проведите ПЦР-реакции в условиях, оптимизированных для каждой пары праймеров, поддерживая количество циклов в пределах линейной фазы амплификации. После завершения ПЦР-реакций удалите ПЦР-праймеры и избыток dNTP, добавив экзонуклеазу I и щелочную фосфатазу креветок (SAP) в каждый ПЦР-продукт и инкубировав смесь при 37 °C в течение 20 минут, а затем при 85 °C в течение 15 минут.

Нанесите каждый ПЦР-продукт дважды на планшет с 384 лунками, чтобы для каждого образца было доступно восемь измерений. Всего 16 точек для основного анализа элонгации. Спроектируйте праймер для элонгации с помощью программного обеспечения по дизайну анализа таким образом, чтобы один и тот же праймер можно было использовать как для продуктов геномной ПЦР, так и для продуктов ПЦР на основе кДНК.

Установите длину праймера в диапазоне от 14 до 18 пар оснований. Проведите первичную реакцию достройки, используя соответствующую смесь из трех дезоксинуклеотидных терминаторов и одного дезоксинуклеотида. Типичная первичная реакция достройки включает начальный этап при 94 °C в течение двух минут, за которым следуют 40 циклов: 94 °C в течение пяти секунд, 52 °C в течение пяти секунд и 72 °C в течение пяти секунд.

Наконец, количество удлиненных олигонуклеотидов определяют методом масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией и временем пролета с помощью масс-спектрометра Spectro Reader. Ключевым моментом данного протокола является использование нескольких стратегий контроля экспериментального шума для исключения артефактов. Очень важно повторить эксперимент как минимум трижды.

Наилучшим контролем для эксперимента является использование клеточной линии, гетерозиготной по анализу на обрезание (snip assay) для первичной экспансии, но не несущей аллель, связанную с заболеванием. Кроме того, следует разработать анализы для альтернативных транскрибируемых кодирующих маркеров ДНК. Если таковые недоступны, дополнительный контроль может быть обеспечен использованием альтернативных пар праймеров для ПЦР, нацеленных на разные экзоны в анализе первичной экспансии.

Внутренний контроль может быть обеспечен путем разработки праймеров для экстензии, отжигающихся как к прямой, так и к обратной цепям. Здесь представлен пример анализа аллель-специфической экспрессии с примерами масс-спектрометрических трейсов. На данном рисунке показаны результаты анализа четырех аллель-специфических продуктов первичной экстензии, проведенного на четырех различных матрицах.

Два верхних графика представляют результаты анализа геномной ДНК двух различных клеточных линий, обе из которых гетерозиготны по транскрибируемому кодирующему полиморфизму. Однако только клеточная линия A гетерозиготна по рискованному варианту ДНК. Два нижних графика представляют результаты анализа кДНК, полученной из тех же клеточных линий в результате экспериментального артефакта.

Первый пик всегда выше второго, в том числе и в геномном анализе. Поэтому результаты геномного анализа используются для нормализации данных кДНК. Статистический анализ проводится путем выгрузки полного отчета о типировании ELO с помощью программного обеспечения для анализа масс-спектров.

В данном отчете представлены данные о площади пика; здесь приведен пример для двух клеточных линий, клеток А и В, которые гетерозиготны по кодирующему однонуклеотидному полиморфизму (SNP), однако только клетка А гетерозиготна по маркеру, связанному с заболеванием. Столбцы, выделенные серым цветом, генерируются программным обеспечением автоматически, в то время как столбцы, выделенные зеленым цветом, рассчитываются вручную для каждой клетки. Для кДНК и геномной ДНК приведено по восемь измерений.

Программное обеспечение вычислит площадь под каждым пиком спектра, которая представляет собой количество каждого из двух аллелей. Отношение аллелей рассчитывается путем деления площади первого аллеля на площадь второго аллеля для каждого образца кДНК и геномной ДНК. По восьми измерениям рассчитываются среднее значение и стандартная ошибка.

Высокая стандартная ошибка (более 0,1) указывает на несогласованность измерений, и такие данные следует игнорировать. Наконец, среднее отношение кДНК нормализуется по среднему отношению геномной ДНК для оценки отклонения от единичного отношения, которое ожидается при отсутствии различий в аллель-специфической экспрессии. Поскольку нормализованное отношение в клетке A отличается от единицы, а в клетке B близко к единице, данные свидетельствуют о том, что клеточная линия A несет вариант ДНК в фазе с аллелем, измеряемым по второму пику, что снижает экспрессию анализируемого гена.

Клеточная линия B служит очень удобным отрицательным контролем. Выполнение данной процедуры крайне важно для определения информативных генетических вариантов и подходящих экспериментальных контролей. Могут быть использованы и другие методы, такие как гаплотип-специфичное иммунопреципитация хроматина, которые помогают ответить на вопросы о генетических вариантах, для которых отсутствуют транскрибируемые маркеры, необходимые для анализа аллель-специфичной экспрессии генов.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить аллель-специфический анализ РНК и как использовать этот метод для изучения функциональных вариантов, имеющих генетическое значение.