Поведенческая фармакология в классической Кондиционирование Ответ хоботок Расширение в Медоносные пчелы ( Apis Mellifera)

Общая цель данной процедуры заключается в изучении молекулярных механизмов, лежащих в основе обучения и формирования памяти. Первым этапом работы с медоносными пчелами является сбор свободно летающих пчел из улья. Затем пчел фиксируют в пластиковых трубках.

Третьим этапом процедуры является проведение классического обусловливания. Препараты могут вводиться в определенные моменты времени вокруг процесса обусловливания для изучения их влияния на обучение и формирование памяти. Заключительным этапом процедуры является тестирование сохранения памяти.

В конечном счете, изменения в поведении после введения препарата могут раскрыть молекулярные механизмы, лежащие в основе обучения и формирования памяти у медоносных пчел. Данный метод может помочь в решении ключевых вопросов в области изучения обучения и памяти, выявляя молекулярные механизмы формирования памяти.

В целом, исследователи, которые только начинают использовать данный метод, могут столкнуться с трудностями, поскольку время предъявления стимулов во время обусловливания и извлечения памяти должно быть строго выверено. Также критически важным является режим кормления. Процедуру продемонстрируют Cutting Gearing и Johannes Faberg аспирантам моей лаборатории. За день до начала эксперимента соберите пчел в период с 14:00 до 16:00, используя пирамиду из плексигласа, пропускающего УФ-излучение.

Вернувшись в лабораторию, установите пирамиду на основание и закройте стенки полотенцем, оставив вершину открытой. Откройте отверстие в вершине и удерживайте над ним стеклянный флакон, позволяя одной пчеле переползти во флакон, после чего снова закройте отверстие. Повторяйте эту процедуру до тех пор, пока все пчелы не будут перенесены в стеклянный флакон (для осеннего и зимнего периодов).

Когда пчелы не летают на улице, улей содержат в теплице в сетке, из которой пчел отлавливают по одной. Используя по одному стеклянному флакону на пчелу, иммобилизуйте насекомое, охлаждая флакон на льду от двух с половиной до трех с половиной минут. Внимательно следите за пчелой и извлеките её из льда, как только она перестанет двигаться.

Зафиксируйте обездвиженную пчелу в небольшой пластиковой пробирке с помощью клейкой ленты. Убедитесь, что пчела может свободно шевелить брюшком, но не может двигать головой, грудью или ногами. Также важно не сдавливать область шеи.

После подготовки пчелы поместите пробирку в пронумерованное отверстие на штативе для удобства манипуляций и идентификации.

Пробирки всегда возвращаются в то же самое отверстие. После проведения манипуляций кормите пчел в период с 16:00 до 18:00 в месте, отделенном от площадки кондиционирования. Вызывайте реакцию вытягивания хоботка (PER), прикасаясь к пчелам и их усикам.

С помощью раствора сахарозы дайте пчеле употребить одну каплю раствора SRA объемом около 4 µL. Следите за тем, чтобы не испачкать антенны, пробос или пластиковую трубку пчелы. Кормите каждую пчелу до тех пор, пока она не перестанет принимать пищу.

Продемонстрируйте быструю и надежную ПР, когда их антенна касается раствора. В последующие вечера эксперимента кормите каждую пчелу четыре раза одной каплей раствора сахарозы. Наполните пластиковую чашу высотой примерно 0,5–1 см водопроводной водой.

Поместите штатив с закрепленными пчелами в чашу, используя чашки для лизиса в качестве платформы. Накройте чашу картоном и храните при комнатной температуре в течение ночи. Ольфакторное обусловливание пчел проводится около 10:00 утра на следующий день после сбора.

За 30 минут до начала эксперимента. Разместите стеллаж с пчелами в упряжках рядом с местом кондиционирования, но вдали от отверстия выхлопной трубы, где будет проходить обучение пчел. Затем подготовьте кондиционирующий стимул, работая в вытяжном шкафу.

С помощью наконечника с фильтром нанесите 4 µL гвоздичного масла на круглый фильтровальный бумажный диск. Поместите пропитанный маслом диск в шприц объемом 20 mL и вставьте поршень. Настройте аудиоплеер, который будет подавать акустический сигнал экспериментатору.

Это обеспечивает точное время подачи стимула, начало и окончание стимуляции, продолжительность и позиционирование. Подготовьтесь к записи поведения пчелы на протяжении всего процесса кондиционирования. Положительный балл присваивается, если пчела вытягивает SSIS в интервале между началом условного стимула и предъявлением безусловного стимула.

Пересечение виртуальной линии между открытыми мандибулами. Чтобы начать пробное обучение, выберите пчелу для тренировки и поместите её перед вытяжкой на 10 секунд. Незадолго до окончания этого десятисекундного интервала расположите шприц с запахом на расстоянии трёх сантиметров от антенн пчелы. Подавайте запах в течение пяти секунд, пропуская через шприц 20 milliliters воздуха.

Спустя три секунды введите безусловный стимул, коснувшись влажной зубочисткой с раствором сахарозы вентральной части дистальных жгутиков обеих антенн. Чтобы раствор не попал на тело пчелы и антенны, после этого пчеле позволяют облизать зубочистку. Данный комбинированный стимул длится четыре секунды, после чего пчел удаляют из контекста обучения и возвращают в штатив.

Одна тренировочная проба длится 28 секунд, при этом условный стимул предъявляется через 13 секунд. Верните пчелу на место тренировки после межпробного интервала в 10 минут. Проведите вторую из трех проб, как показано ранее, и подождите еще 10 минут перед выполнением финального спаривания.

По завершении ежедневного обучения верните стойки обратно в чашу. Не забудьте покормить каждую пчелу четыре раза, давая по одной капле раствора сахарозы объемом 4 µL в период с 16:00 до 18:00. Как было показано ранее, тесты на удержание памяти можно проводить через любой интервал времени после обучения — от нескольких минут до нескольких дней. Чтобы подготовиться к тесту на память, поместите стойку с пчелами рядом с местом кондиционирования на 30 минут.

Начните тестирование, поместив пчелу перед выхлопным отверстием на 10 секунд. Предъявите кондиционирующий стимул в течение пяти секунд и зафиксируйте возникновение PER. После завершения тестирования за день верните штативы в чашу.

Помните, что каждую пчелу необходимо кормить четыре раза, давая по одной капле раствора сахарозы объемом 4 µL в период с 16:00 до 18:00. По окончании всего эксперимента, как было продемонстрировано ранее, убедитесь, что пчела все еще способна вытягивать хоботок, коснувшись усика раствором SRA; такие пчелы должны быть включены в анализ. Пчелы должны выжить на протяжении всего эксперимента и иметь неповрежденный PER. В некоторых исследованиях для изучения влияния фармакологического вмешательства на обонятельную память используются системные инъекции. Эти инъекции могут вводиться в разное время в зависимости от плана эксперимента.

Для начала с помощью одноразовой игольчатой иглы сделайте небольшое отверстие в кутикуле задней части S scootin рядом с щелью S scootle над летательной мышцей. Затем наполните стеклянную капиллярную трубку одним микролитром тестируемого раствора. Вставьте капилляр в отверстие в кутикуле и введите раствор в летательную мышцу.

Опытные экспериментаторы способны вводить одну дозу B каждые 30 секунд, что обеспечивает точное время введения препарата и проведения кондиционирования. Здесь представлены два эксперимента. В первом эксперименте изучается влияние системной инъекции физиологического раствора, введенной перед обучением, на формирование памяти.

В данном исследовании участвуют три группы: группа А, не получавшая лечения, группа, которой вводили системную инъекцию 1 µL фосфатно-солевого буферного раствора, и контрольная группа (имитация воздействия). Эти манипуляции проводились за 30 минут до начала обучения, показанного здесь слева. Процент животных, демонстрировавших условный ответ в процессе формирования навыка, увеличивался на протяжении трех тренировочных сессий, при этом значимых различий между группами не наблюдалось.

Столбчатые диаграммы справа показывают, что ни инъекция PBS, ни имитация повреждения не повлияли на сохранение памяти. Спустя 24 часа после обучения во втором эксперименте инъекции проводили через 40 минут после обучения; пчел разделили на одну группу, получавшую физиологический раствор, и другую, получавшую один микролит ингибитора синтеза белка anisomycin. Столбчатые диаграммы справа демонстрируют явное снижение сохранения памяти у пчел, получавших anisomycin. Эти результаты подчеркивают важность синтеза белка в формировании обонятельной памяти.

После выполнения данной процедуры можно провести электрофизиологические записи, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, какова нейрофизиологическая основа обучения и формирования памяти после их развития? Этот метод открыл исследователям в области изучения обучения и памяти путь к изучению молекулярных и нейрофизиологических механизмов формирования памяти у медоносной пчелы.