Стабильный Изотопный Профилирование посредник Flux Метаболический в развивающихся странах и взрослой стадии Caenorhabditis Элеганс

Общая цель следующего эксперимента заключается в неинвазивном мониторинге в режиме реального времени метаболических изменений на уровне всего организма в процессах гликолиза, метаболизма пирувата и цикла трикарбоновых кислот, вызванных отдельными метаболическими путями, генетическими изменениями и/или фармакологическим воздействием. Это достигается путем скармливания стабильных изотопов живым нематодам для обеспечения достаточного изотопного обогащения множества метаболитов, что позволяет количественно оценить генетические и/или фармакологические изменения в промежуточных метаболических путях. На втором этапе измеряется включение изотопов в атмосферный и растворенный углекислый газ с помощью газовой масс-спектрометрии соотношений, что обеспечивает более прямую оценку промежуточного метаболического потока за короткие периоды времени.

Далее образцы обрабатывают для анализа свободных аминокислот всего червя методом ВЭЖХ, а также для определения изотопного обогащения аминокислотами и органическими кислотами методом ГХМС с целью количественной оценки изменений метаболических потоков у нематод. После воздействия стабильных изотопов получены результаты, демонстрирующие влияние различной продолжительности экспозиции изотопам, очистки от бактерий и альтернативных способов разрушения червя у особей дикого типа для изучения изотопного состава промежуточных метаболитов. Данный метод позволяет получить представление о промежуточном обмене веществ.

Данный метод также может быть применен к нашим системам, таким как клеточные линии и ткани млекопитающих. Идея этого метода возникла у нас, когда при анализе свободных аминокислот червей с помощью ВЭЖХ мы заметили постоянные отклонения, указывающие на нарушение промежуточного метаболического потока при первичных изменениях респираторной функции. Для начала данной процедуры.

Червей, подвергнутых воздействию метаболического предшественника, меченного стабильным изотопом, либо в процессе развития, либо во взрослом состоянии, собирают в пластиковую центрифужную пробирку объемом 1.5 мл. Обычно мы разбавляют суспензию червей до концентрации 1000 особей на 1 мл. К червям добавляют 60% перхлористую кислоту, содержащую эпсилон-аминокапроновую кислоту в качестве внутреннего стандарта, до конечной концентрации 4% перхлористой кислоты и 20 нМ внутреннего стандарта.

Дайте червям осесть под действием силы тяжести в течение пяти минут, затем удалите и сохраните супернатант в отдельной пробирке. Следующий этап является одним из наиболее критических аспектов данной процедуры. Перед анализом свободных метаболитов черви должны быть полностью разрушены путем гомогенизации. Используя пластический гомогенизатор и электрическую дрель, измельчайте образцы червей в течение 15 секунд.

Визуально подтвердите разрушение червей с помощью световой микроскопии и при необходимости повторите измельчение. На этом изображении на панелях A и B показаны черви до измельчения. В отличие от панелей C и D, на которых показаны черви после измельчения, перенесите ранее сохраненный супернатант в пластиковые центрифужные пробирки объемом 1.5 миллилитр с гомогенатом червей для центрифугирования.

Центрифугируйте образцы при 2 250 об/мин (1300 G) в течение пяти минут. После центрифугирования перенесите супернатант в чистую стеклянную пробирку объемом семь миллилитров. Осадок сохраните для последующего использования в анализе концентрации белка.

Теперь добавьте четыре нормальных раствора гидроксида калия в СУПЕРНАТАТАТ до достижения диапазона pH образцов от семи до восьми, затем центрифугируйте. Нейтрализованные образцы в стеклянных пробирках объемом семь миллилитров центрифугируют при 2 250 об/мин (1300 G) в течение пяти минут. Для удаления солей перенесите супернатант из каждого образца в новую стеклянную пробирку объемом семь миллилитров. Теперь нейтрализованные образцы можно подготовить для количественного определения метаболитов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) или газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС). Для ВЭЖХ.

Отберите по 50 µL каждой нейтрализованной пробы для прямого ввода в ВЭЖХ. Количественное определение свободных аминокислот проводится с использованием предварительной дериватизации альдегидом и флуоресцентного детектирования. Как было описано ранее, остальные нейтрализованные пробы будут подвергнуты экстракции с использованием ионообменной смолы для ГХ-МС с целью определения изотопного обогащения аминокислот и органических кислот, как показано в следующем разделе.

Для подготовки гранул добавьте 1 н. раствор соляной кислоты к гранулам G1 и G50 по отдельности. В стаканах объемом 1 л перемешивайте содержимое каждой колбы в течение 30 минут с помощью магнитной мешалки. После этого промойте гранулы деионизированной водой 10 раз, пока pH промывных вод не сравняется с pH воды.

Далее мы продемонстрируем метод изготовления бюджетных колонок из стеклянных пипеток. Также можно использовать готовые коммерческие колонки. Для подготовки колонки с помощью пинцета вставьте ватную пробку чуть выше самой узкой части кончика пастуровской пипетки; используйте сорбент G 1 для экстракции органических кислот и сорбент G 50.

Для экстракции аминокислот заполните каждую колонку примерно на одну треть её высоты. Если образец уже имеет нейтральный pH, перед нанесением на колонку AG 1 в него ничего не добавляют. Чтобы экстрагировать органические кислоты для последующего выделения аминокислот, перед нанесением на колонку AG 50 добавьте в образец один миллилитр 0,1 н. соляной кислоты.

Теперь нанесите предварительно подготовленные нейтрализованные образцы на каждую колонку. Промойте каждую колонку водой 10 раз до достижения нейтрального значения промывных вод. После завершения промывки элюируйте содержимое каждой колонки в чистые промаркированные стеклянные виалы для образцов объемом четыре миллилитра. Для экстракции органических кислот добавьте три миллилитра трехнормального раствора соляной кислоты в колонку AG 1.

Это позволяет анализировать изотопное обогащение по общему количеству меченых атомов углерода среди трех-, четырех-, пяти- и шестиуглеродных соединений. Для экстракции аминокислот на колонку G 50 добавьте три миллилитра 4Н гидроксида аммония. Это позволяет анализировать изотопное обогащение по общему количеству меченых атомов углерода среди трех- и пятиуглеродных соединений.

По завершении экстракции органических кислот и аминокислот поместите флаконы с образцами в испаритель reactive app three на ночь до полного высыхания. Затем образцы подвергаются дериватизации и анализируются с помощью GCMS, как подробно описано в тексте протокола. Начните данную процедуру с переноса тысячи молодых взрослых червей на экспериментальную 35-миллиметровую чашку с NGM-агаром, содержащим глюкозу с универсальной меткой по углероду 13 и e coli.

Затем поместите экспериментальную чашку с NGM без крышки в специальную стеклянную камеру, оснащенную герметичным трехходовым краном для точного отбора проб и замены атмосферы. Смажьте вакуумной смазкой место уплотнения, где оптически прозрачный стеклянный диск прилегает к чашке.

Герметизируйте камеру стеклянным диском. Зафиксируйте время. Через 30 минут, приняв это за момент времени ноль, с помощью шприца объемом 20 миллилитров отберите пробу 10 миллилитров атмосферы из стеклянной камеры через трехходовой кран.

Закройте кран, ведущий в камеру. После отбора пробы перенесите образец в вакуумную стеклянную пробирку с красной крышкой, содержащую 1 мл бикарбоната натрия в 0,1 М растворе гидроксида натрия. Затем введите 10 мл воздуха в стеклянную камеру через трехходовой кран. С помощью шприца объемом 20 мл закройте кран, ведущий в камеру. После повторного введения воздуха и перед возобновлением инкубации повторите отбор проб атмосферы из стеклянной камеры через 60, 90 и 120 минут.

Проанализируйте данные образцы атмосферного диоксида углерода на обогащение меченым углеродом с помощью газового изотопного масс-спектрометра, как описано в тексте Протокола; стабильные изотопы хорошо включаются через два часа в организмы молодых взрослых червей, что подтверждается здесь измерением меченого углерода в атмосферном диоксиде углерода и растворенном диоксиде углерода в червях, которых кормили либо живыми, либо убитыми УФ-излучением клетками OP 50 e coli. Отношение CO₂ с углеродом 13 к CO₂ с углеродом 12 было выше во фракции растворенного в червях диоксида углерода по сравнению с высвобожденным атмосферным диоксидом углерода. Было замечено, что длительное воздействие стабильного изотопа с личиночного периода с последующим содержанием червей на среде NGM Aate без бактерий приводило к увеличению изотопного обогащения свободного глутамата у молодых взрослых червей.

На этом графике L1 обозначает червей, которых кормили универсально меченой глюкозой с углеродом 13 и бактериями OP 50 с личиночной стадии L1 до стадии молодого взрослого организма 959 cell; YA обозначает червей, которых кормили глюкозой с углеродом 13 и бактериями OP 50 в течение 48 часов, начиная с первого дня откладки яиц на стадии молодого взрослого организма. Ось X указывает общее количество меченых атомов углерода в каждом виде глутамата, а ось Y указывает процент обогащения. Перед последующей подготовкой проб все животные были очищены от избыточной изотопной метки.

Для анализов ГХ-МС зеленые столбцы обозначают червей, очищенных после изотопного воздействия путем кормления штаммом E coli OP 50 на чашках с NGM в течение двух часов перед экстракцией ПХА. Синие и серые столбцы обозначают червей, очищенных после изотопного воздействия на чашках с NGM без бактерий в течение двух или шести часов соответственно перед экстракцией ПХА, независимо от временного курса изотопного воздействия. При очистке животных на чашках в течение двух или шести часов значимых различий в изотопном обогащении промежуточных метаболитов не наблюдалось.

В обоих курсах изотопного воздействия наблюдалось меньшее изотопное обогащение промежуточных метаболитов, когда очистка животных проводилась путем кормления немаркированными бактериями в течение двух часов. Таким образом, оптимальный протокол очистки для червей, выращенных на чашках NGM с бактериальным посевом и изотопом, был определен как очистка в течение двух часов на чашках NGM без посева для оптимизации процента обогащения промежуточных метаболитов. После обработки в течение 24 часов в жидкой культуре с одним 13C-глюкозой (шестиуглеродным) без бактерий.

На данном рисунке представлено сравнение образцов червей, разрушенных только путем соникации, а также путем соникации в сочетании с измельчением. Образцы червей, подвергнутые соникации и измельчению, имели более высокую степень изотопного обогащения, чем образцы, разрушенные только соникацией; в конечном итоге живых червей скармливали стабильным изотопным предшественником либо в процессе развития, начиная со стадии L1 на чашках, либо с первого дня откладки яиц в молодом взрослом состоянии в течение 24 часов в жидкой культуре. Это позволило провести прецизионный анализ изотопного обогащения метаболитов, характеризующих поток через гликолиз и метаболизм пирувата в цикле трикарбоновых кислот после его развития.

Данный метод открыл возможности для исследований митохондриальных заболеваний с целью изучения промежуточного метаболического потока у C. elegans. После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как проводить профилирование промежуточного метаболизма и метаболического потока с помощью стабильных изотопов у нематод C. elegans.