Протокол Анализы RNAi у взрослых комаров (А. gambiae)

Меня зовут Линдси Гарвер, и я учусь в аспирантуре в лаборатории доктора Джорджа Димопулоса в Школе общественного здравоохранения Джона Хопкинса. И я покажу вам, как проводить РНК-интерференцированное подавление генов с помощью техники инъекций. Итак, первым шагом является сбор комаров, которых мы собираемся вводить.

Это просто ужасно Габи. Это смесь самцов и самок. А это наш аспиратор на батарейках.

Он имеет вентилятор внутри, который будет создавать всасывание, втягивая комаров вверх через эту насадку в этот резервуар. Итак, мы отключаемся. У нас есть маленькая дверца, которая обычно заклеена скотчем, чтобы комары оставались внутри, но мы открываем ее, вставляем насадку, включаем ее и используем для сбора.

Как только комары оказались внутри, мы затыкаем верхнюю часть насадки, видим комаров там, в резервуаре. Затем мы хотим обезболить этих комаров. Итак, закапываем этот водоем в ведро со льдом, накрываем льдом и ждем, когда комары спустятся вниз.

Хорошо, следующим шагом будет введение Комаров, и чтобы использовать их, мы будем использовать это, это нано-джет два. Он состоит из части палочки, которую я буду держать. А в нем будет содержаться игла, которая будет выдавать жидкость комару.

Панель управления, которая имеет кнопки заполнения и опорожнения и отвечает за втягивание жидкости в иглу и из нее. А вот это и есть подножка. Это будет положено на пол.

И если надавить на него ногой, то одна капля соответствующего объема попадет в комара. Итак, пока комары лежат на льду, мы подготавливаем рабочее место, устанавливая холодный блок на ноль градусов до двух градусов по Цельсию. Этот холодный блок имеет плоскую насадку, на которой затем монтируется предметное стекло.

И это не даст комарам двигаться, пока мы пытаемся ими манипулировать. Я также возьму одну из этих стеклянных капиллярных игл. Это просто обычная стеклянная капиллярная трубка, которая была нагрета и вытянута посередине для создания иглы.

И это то, что будет удерживать нашу жидкость. И это то, что мы будем использовать для инъекции комара и дозирования жидкости. Итак, следующее, что нам нужно сделать, это поместить капиллярную иглу на нашу инъекционную палочку.

Снимаем носовую часть. Убедитесь, что внутренние кольца расположены в соответствии с инструкциями производителя. Вставьте стеклянную иглу вниз в носовую часть, осторожно относясь к кончику, чтобы не сломать его.

Как только это будет закреплено, вставьте иглу палочки в капиллярную иглу и плотно закрутите носовую часть. Затем убедитесь, что игла капиллярной трубки имеет достаточную ширину для инъекций. Это действительно важный момент, потому что слишком тонкая игла не выдаст нужное количество жидкости, а слишком толстая игла может поранить комара и, возможно, привести к смерти.

Это то, что требует большой практики, но хорошая ширина на самом деле имеет решающее значение для правильной инъекции и выживания ваших комаров. Что я делаю, так это использую щипцы с тонкими наконечниками, чтобы сломать кончик иглы так, чтобы игла оставалась податливой, но стабильной. Нам нужен наш образец двухцепочечной РНК.

Этот образец был подготовлен с помощью набора. На рынке представлено множество наборов, которые могут генерировать специфические РНК двойного стандарта для интересующего гена. Мы используем наши РНК в концентрации три микрограмма на микролитр, и у нас есть набор для наноинъекций, чтобы одна инъекция выдавала 69 нанолитров.

Трубка вводит нашу иглу в жидкость и с помощью кнопки наполнения на n выбрасываем, чтобы набрать жидкость в иглу. Количество жидкости, которое вам понадобится в игле, прямо пропорционально количеству комаров, которых вы будете вводить. Хорошо? А нам теперь нужно готовить комаров.

Итак, мы берем нашу пластиковую тарелку P two и вставляем ее в ведро со льдом. Мы проверяем, что наши комары не двигаются, и разкладываем их тонким слоем на холодной чашке Петри. Это гарантирует, что во время работы комары не двигаются и не летают.

Затем мы размещаем комаров на нашем предметном стекле, которое сейчас находится на ноль градусов по Цельсию. И расположение комаров имеет решающее значение для того, как мы их заносим. Итак, вы хотите, чтобы ваши комары были выстроены в линию, чтобы вы знали, какие из них были уколы, а какие нет.

Кроме того, вы хотите, чтобы между комарами было достаточно места, чтобы вы могли добраться до них с помощью инжектора. Поэтому мы переносим отдельных комаров из миски на горку, заботясь о том, чтобы держать их за ноги. Это позволяет избежать сдавливания тел и приводит к большей выживаемости.

Итак, теперь мы готовы к инъекции. Мы используем щипцы с тонким кончиком, чтобы поддержать комара с одной стороны, я правша, поэтому я использую его в левой руке. А затем вводим с другой стороны, вводя кончик иглы в боковую часть грудной клетки, так, чтобы грудная клетка комара оказалась зажатой между кончиками щипцов и острием иглы и острие иглы вошло внутрь.

Как только острие иглы окажется внутри грудной клетки, нажмите на ножную педаль, вы услышите звуковой сигнал, и жидкость будет выдана в грудную клетку комара. Затем вы переходите к следующему и повторяете. Время от времени, когда вы извлекаете иглу, вы будете видеть, как капля жидкости вышла из места введения.

И если это произойдет, то можно дождаться, когда жидкость снова впитается в место входа. Если это произойдет, это нормально. Если капля не всасывается обратно, если капля остается на внешней стороне грудной клетки, то этого комара нужно выбросить, и вы вводите на его место другого.

Также важно убедиться, что игла проникает в грудную клетку ровно настолько, насколько это необходимо. Вы же не хотите протыкать иглу на другую сторону или пропускать иглу слишком большой ширины. Выживание грудной клетки или комара будет поставлено под угрозу.

Поэтому мы продолжаем эту процедуру для всех комаров по мере необходимости. Поэтому для хранения ваших инъекционных комаров мы использовали картонную чашку объемом в одну пинту, покрытую воском, которая была покрыта тонкой сеткой и закреплена резинкой и картонной крышкой. Мы открыли входную дверь, которая обклеена скотчем и аккуратно добавили наших комаров, чтобы помочь вашим комарам выжить.

Вы должны добавить ватный тампон, который был смочен с 10% раствором сахарозы, который действует как источник пищи для комаров, пока они находятся здесь. И влажное сложенное бумажное полотенце. Поскольку раненые комары имеют тенденцию к высыханию, это поможет сохранить влажность и поможет выжить вашим инъекционным комарам.

Сверху мы накрываем крышкой Петри, чтобы удерживать влагу, чтобы наше бумажное полотенце и ватные шарики оставались влажными. А затем мы инкубируем его в нормальных условиях окружающей среды. Таким образом, молекулярная кинетика подавления экспрессии генов, опосредованной РНК-интерференцией, довольно сильно варьируется от гена к гену.

Таким образом, для некоторых генов подавление может произойти в течение дня, а для других генов эффективное подавление может произойти только в течение нескольких дней. Различия между каждым геном можно измерить с помощью количественной ПЦР в режиме реального времени, которая будет контролировать уровни транскриптов в организме комаров и сообщит вам, когда вы достигнете эффективного подавления электрошока. Поэтому я бы рекомендовал отложить пару инъекционных комаров для этой цели.

Это также поможет вам определить, насколько эффективны ваши двухцепочечные РНК в целом, можете ли вы, ваши конкретные двухцепочечные РНК достичь эффективного подавления. И если вы на самом деле вмешиваетесь в уровни транскриптов, я только что показал вам процедуру опосредованного РНК-интерференцией подавления гена аномальных гамбийских комаров. Эта процедура включает в себя микроинъекцию двухцепочечных РНК в грудную клетку комаров Anole Gabi.

Эта процедура важна, потому что это один из самых простых и эффективных способов манипулирования отдельными генами у комаров.