Мышь Модель В утробе матери Трансплантации

Общая цель этой процедуры заключается в пересадке клеток или вирусов плодам мышей. Сначала сделайте надрез на вентральной стороне мыши. Далее проводится экстериоризация матки и плода, а затем выполняются внутриутробные инъекции.

Наконец, аккуратно верните матку обратно в брюшную полость и закройте брюшную фасцию и кожу. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые демонстрируют клеточное приживление или экспрессию генов с помощью проточной цитометрии ПЦР или иммуногистохимии При трансплантации стволовых клеток матки и генной терапии. Благодаря нашим инновационным стратегиям лечения врожденных нарушений до рождения мы можем использовать иммунную систему незрелого плода, чтобы вызвать толерантность к аллогенным клеткам или сформировать белки.

Мышиная модель внутриутробной трансплантации позволяет изучить уникальные для плода биологические факторы, которые приводят к успешной индукции непереносимости приживляемого приживления. Теперь эту технику продемонстрирует Амер Ниал, хирург и постдокторант в моей лаборатории. Подготовка инъекционных пипеток начинается с вытягивания стеклянных пипеток с помощью съемника пипеток, который был откалиброван для разделения пипетки.

В течение 15 секунд поместите пипетку в съемник пипеток и закрепите ее на месте с помощью верхнего и нижнего зажимов. Далее нажмите кнопку вытягивания. Нить нагреется, и пипетка отделится.

Пипетка будет иметь конус, где она отделяет срез конца пипетки таким образом, чтобы расстояние от начала конуса до конца пипетки составляло от 1,04 до 1,05 сантиметра. Потому что длина пипетки обратно пропорциональна калибру отверстия пипетки. Изготовление более длинной пипетки приведет к более слабому наконечнику, который будет более подвержен поломке во время инъекции и может повлиять на выживание эмбриона мыши, которому была сделана инъекция.

Чтобы создать гладкий скос, наконечник пипетки должен быть заточен на алмазном точильном круге. Включите колесо, а затем осторожно опустите пипетку на вращающееся колесо для заточки. Когда пипетка изначально разрезана, она часто ломается с естественным скосом.

На кончике периодически пересматривайте пипетку через прилагаемый микроскоп, чтобы убедиться, что пипетка все еще касается колеса. Потому что по мере того, как фаска становится гладкой, она будет терять контакт с заточным кругом. Как только скос станет гладким, кончик пипетки необходимо заточить.

Поднимите пипетку так, чтобы она больше не касалась точильного круга. Поверните его по часовой стрелке на 10–50 градусов и поместите пипетку обратно на вращающееся колесо для заточки примерно на 10 секунд. Будьте осторожны и не размещайте пипетку на краю слишком долго, иначе у нее может образоваться неровная поверхность.

Извлеките пипетку из заточного круга и осмотрите край. Этот шаг обычно нужно повторить с несколькими небольшими корректировками, чтобы создать острый край. Завершив одну сторону, заточите противоположный край таким же образом, как было только что продемонстрировано.

На этой схеме показана правильная заточка пипеток для инъекций, вид снизу правильно заточенного скоса иглы и вид сбоку пипетки с неровным краем. Наконец, используйте перманентный маркер, чтобы нарисовать окружную линию. Каждые четыре миллиметра, начиная с того места, где начинается конус пипетки, эти разграничения соответствуют пяти микролитрам объема.

После подготовки инъекции, пипеток и инъекционного материала можно приступать к инъекциям. Сначала дважды очистите инъекционный дозатор одним XPBS, погрузите пипетку в PBS и нажмите кнопку заполнения, пока не будет отсасовано достаточно жидкости для заполнения пипетки. Затем каждый проверяет PBS.

Затем подготовьте процедурную зону с помощью согревающего одеяла, освещения и необходимых хирургических инструментов. Инъекции будут делаться с использованием хирургических петлей увеличения в 2,5 раза. В этой демонстрации, хотя можно также использовать препарирующий микроскоп, поместите мышь под наркозом на грелку в положении лежа на спине и прикрепите каждую конечность скотчем, чтобы зафиксировать животное на месте.

После стрижки шерсти подготовьте брюшную полость 10% повидон-йодом, а затем спиртом, подтвердив щипком пальца ноги, что животное полностью обезболило. Затем сделайте разрез в один сантиметр внизу живота. Самый низкий аспект разреза должен быть примерно на один сантиметр выше, чем надрез кожи и фасции.

Будьте осторожны, чтобы не травмировать кишечник и мочевой пузырь, которые находятся непосредственно под тонким слоем фасции. С помощью ватных палочек аккуратно растяните фасцию и проведите гр матки через разрез. Определите правый и левый яичники, чтобы убедиться, что вы визуализируете всю матку, а затем подсчитайте общее количество плодов.

Поместите матку обратно в брюшную полость, прежде чем продолжить, чтобы плод оставался в тепле, пока вы готовитесь к инъекциям. Поскольку инъекционные материалы обычно находятся в небольшом объеме, мы обычно помещаем их в небольшую микропробирку, чтобы иметь возможность заполнить иглу, не сломав наконечник пипетки. Поскольку инъекции являются самым сложным аспектом этой процедуры, хорошая техника, которая приводит к минимальной травматизации матки, имеет решающее значение для успеха этой техники.

Плод необходимо держать крепко, но достаточно нежно, чтобы избежать повреждений. Также крайне важно, чтобы ваши движения были устойчивыми во время введения инъекции и извлечения пипетки. Составьте подходящий объем материала для того количества плодов, которое вы планируете вводить.

Важно сохранить наконечники дозаторов меров, чтобы избежать аспирации образца в трубку микроинжектора. Осторожно подержите плод и определите часть плода, которую вы планируете сделать инъекцию. В этой демонстрации мы будем вводить каждому плоду разные части тела, первой из которых будет печень плода.

Большим и указательным пальцами стабилизируйте плод в амниотической полости, чтобы он не вращался во время выполнения инъекции. Для введения в печень осторожно вводят пипетку через матку, амнион и кожу плода, а также в печень плода. Острая пипетка должна легко проходить через эти ткани.

Введите желаемый объем в плод и аккуратно извлеките пипетку. Крайне важно, чтобы ваши движения были устойчивыми во время введения, введения и вывода пипетки для внутрибрюшинных инъекций. Пипетка также вводится через матку, амнион и кожу плода, но направлена немного ниже печени плода.

Введите нужный объем для внутримышечных инъекций. Расположите плод так, чтобы определить бедро и бедренную кость, и введите ягодичную мышцу. При внутрижелудочковых инъекциях легко увидеть коронарные швы, чтобы направить пипетку к соответствующей цели для этих инъекций.

Для проникновения в череп без разрушения пипетки требуются пипетки чуть большего калибра. Для исследований, которые включают постнатальный забор, все плоды должны получать технически совершенные инъекции, поскольку нет возможности различить, были ли инъекции и неинъекции плода после рождения. Если инъекции сделаны правильно, материал не должен вытекать из околоплодных вод или матки.

После того, как плод был введен инъекцией, осторожно поместите матку обратно в брюшную полость, следя за тем, чтобы она не перекручивалась на себя или вокруг своего сосудистого питания. Введите один миллилитр одного XPBS в брюшную полость матери, чтобы восполнить жидкость, которая была потеряна во время процедуры. Закройте разрез в два слоя рассасывающимся швом из пяти о.

Сначала закройте фасцию, не травмируя подлежащий кишечник или мочевой пузырь, а затем закройте кожу. Наконец, верните введенную самку в ее индивидуальную клетку. Поместите клетку на утепляющее одеяло и подстилку в клетку.

Поместите мышь в тихое место в помещении для работы с мышами, где ее не следует беспокоить в течение нескольких дней после доставки. Минимизация любого дополнительного стресса для животного снизит шансы на преждевременные роды, репрезентативные результаты приживления донора после внутриутробной клеточной трансплантации. Эмбриональный. На 14-й день плодам были пересажены GFP-положительные гемопоэтические стволовые клетки.

Затем был проведен забор периферической крови у химерного щенка для определения экспрессии GFP донорских клеток с помощью проточной цитометрии, которая подтвердила наличие донорских клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как делать инъекционные пипетки и выполнять внутриутробные инъекции. Как только эти фундаментальные техники будут освоены.

Этот метод может быть модифицирован для введения эмбрионов на различных сроках беременности для изучения основ развития и биологии стволовых клеток.