Органотипической культуре Кусочек GFP-экспрессирующих эмбрионов мыши для реального времени изображений периферической нервной вырост

Общая цель этой процедуры заключается в подготовке органотипических поперечных срезов области передних конечностей GFP, экспрессирующих эмбрионы мышей, для визуализации роста спинномозгового нерва. Это достигается путем предварительного встраивания эмбрионов в арос с низкой температурой плавления и ограничения площади ткани и ароса областью интереса. Затем устанавливается блок aros для нарезки.

Затем эмбрионы, внедренные в блок, нарезаются с помощью вибратора. Заключительным этапом процедуры является удаление срезов вокруг ломтиков и перенос срезов в тарелки для культивирования. Затем срезы культивируются и показывают отрастание периферических нервов на периферию, которое можно контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии.

Основное преимущество этой техники по сравнению с существующими методами, такими как гильотина или измельчитель тканей, заключается в том, что срезы генерируются более контролируемым образом и демонстрируют улучшенную жизнеспособность в культуре. Таким образом, этот метод может помочь в изучении нейробиологии развития, например, глядя на направление и разрастание спинномозговых нервов, демонстрируя процедуру Изабель Барман. Начните эту процедуру с подготовки 10-сантиметровых тканевых культуральных планшетов с шестью миллилитрами питательной среды и трехсантиметровыми миллиметрическими клочными сантиметрами, культуральными мембранными вставками 0,4 микрона.

Держите их в инкубаторе при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Затем нагрейте 4% низкую температуру плавления в PBS в микроволновой печи и держите его на нагревательной плите так, чтобы он оставался на уровне примерно 37 градусов по Цельсию. Наполните 10-сантиметровые бактериологические чашки Петри PBS и поставьте их на лед.

Затем настройте охлаждающее устройство Viome. Храните буферный лоток и охлаждающие элементы в морозильной камере до полного замораживания для реализации эмбриона. Встраивая сначала рассекают эмбрионы из матки.

Рассмотрите их с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа и проверьте экспрессию GFP. Затем поместите эмбрионы на перевернутую 10-сантиметровую чашку Петри, используя полоски бумаги Ватмана, чтобы сориентировать их и удалить излишки PBS. Нанесите арос на эмбрион с целью его фиксации.

В ориентированном положении подождите, пока арос застынет, обрежьте излишки ароса и, при желании, ткани, окружающей среднюю часть эмбриона. Поверните внедренный эмбрион на другую сторону. Нанесите дополнительные арос на эмбриональную ткань, чтобы убедиться, что эмбрион полностью приживется.

Подождите, пока арос застынет. Подготовьте зародышевый засаженный арос блок с чистыми краями. Наконец, приклейте образец на патрон с помощью Loctite 4 0 6.

Установите предварительно охлажденный буферный лоток и охлаждающие элементы. Поместите патрон с приклеенной салфеткой на виоме. Добавьте один X-H-B-S-S в патрон, пока ткань не будет покрыта.

Вставьте предварительно очищенное лезвие в держатель лезвия. Далее подготовьте поперечные ломтики толщиной примерно от 350 до 450 мкм. Каждый ломтик нарезается с помощью микротома HM six 50 В.

Переложите срезы в планшеты для тканевых культур с помощью укороченной стеклянной пастбищной пипетки и держите их на льду. С помощью пары щипцов аккуратно удалите арос со всех срезов. Затем переложите срезы на миллимембраны клеточных культур с расположением по четыре среза на каждой мембране на 10-сантиметровые культуральные планшеты, заполненные шестью миллилитрами предварительно прогретой культуры. Терпимая.

Инкубируйте срезы при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа до начала интервальной съемки и между интервалами визуализации. Поместите планшет для культуры тканей, содержащий мембраны клеточных культур Милли со срезами, под вертикальный флуоресцентный микроскоп и определите местоположение спинномозговых нервов на изображении разрастания спинномозгового нерва с помощью четырех объективов x 10 x или 20 x. Пометьте ориентацию мембран милликлеточных культур на предметном столике микроскопа, чтобы правильно изменить их положение во время следующей точки визуализации в случае, если температура и углекислый газ не стабильны.

Показанная здесь среда представляет собой серию изображений роста спинномозгового нерва в течение 24 часов культивирования в поперечном срезе гомозиготного тау-эмбриона GFP. Звездочкой обозначены мотонейроны вентрального спинного мозга, а стрелкой – ДРГ. Верхняя панель была сфотографирована с помощью объектива с четырьмя Х, а нижняя — с объективом с 10 Х.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как готовить органотипические поперечные срезы эмбрионов мыши, которые можно использовать для визуализации разрастания спинномозгового нерва.