Физиологические Записи высокого и низкого NMJs Выход на Экстензорных мышцы ног раков

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать способ выявления и разграничения фазических и тонических двигательных окончаний с помощью морфологического окрашивания и электрофизиологической регистрации в разгибательной мышце рака. Для этого сначала отрывают первую или вторую ходильную ногу рака среднего размера, вырезают кутикулу и удаляют мышцу-сгибатель в сегменте мейта. Это позволяет обнажить разгибательную мышцу и нервный пучок.

Вторым этапом процедуры является окрашивание препарата 4-этил-амино-N-этил-N-метилпериклоридом или 4D2ASP для визуализации аксонов и нервных терминалей. Третий этап процедуры заключается в селективной стимуляции тонических и/или фазических нейронов с одновременной внутриклеточной регистрацией вызванных ВПСП в мышечном волокне. Заключительный этап процедуры — использование фокального электрода для регистрации спонтанных и вызванных квантовых событий (qu events) в терминалях.

В конечном итоге можно получить результаты, позволяющие дифференцировать тонические и фазические терминали морфологически и физиологически с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии и электрофизиологии. Данный метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области синаптической физиологии, касающиеся таких явлений, как мышечная усталость, синаптическая депрессия и синаптическое перекрестное взаимодействие. Эксперимент начинается с осторожного захвата река, чтобы избежать контакта с его клешнями.

Отделите ногу от тела в сегменте ишиа-пода. Сильный зажим в области сегмента ишиа-пода побуждает рака к автотомии или естественному отделению первой ходильной ноги. Кровотечение у рака прекратится, после чего его возвращают в резервуар для содержания.

Рак не забивается. Положите ногу на кусочек бумажного полотенца, чтобы препарат можно было легко поворачивать во время выполнения разрезов. Поворачивайте ногу до тех пор, пока внешняя (латеральная) сторона не окажется обращенной вверх на препарировочной доске.

Как правило, выпуклая сторона должна быть обращена вверх. С помощью острого лезвия бритвы, закрепленного в ломателе скальпельных лезвий, сделайте надрез кутикулы в сегменте мейты, следуя схеме, показанной на рисунке. Будьте осторожны, чтобы не сделать слишком глубокий дистальный надрез при разрезе от дорсальной к вентральной стороне вдоль карпо-меитального сустава.

В результате этого разреза в кутикуле над лежащими ниже мышцами ноги образуется окно. Пока оставьте кутикулу на месте. Поместите препарат в диссекционную чашку с физиологическим раствором для раков.

На этом этапе с помощью тонкого пинцета закрепите булавкой середину сегмента carpod и дорсальную сторону сегмента ischia pod, слегка приподнимите с дистального конца вырезанное в кутикуле окно и с помощью лезвия отделите волокна мышцы-сгибателя от кутикулы. Продолжайте разрезание в направлении от дистального к проксимальному концу, а затем полностью снимите вырезанное окно кутикулы. Для обнажения мышцы-разгибателя необходимо удалить расположенную над ней мышцу-сгибатель.

Отделите сухожилие мышцы-сгибателя, отодвинув его от мышцы с помощью иглы. Затем перережьте сухожилие в области запястного сустава. Как показано на видео, будьте очень осторожны: перед разрезом отведите сухожилие от полости ноги, чтобы перерезать только само сухожилие, не задев основной нерв ноги, расположенный с внутренней стороны сухожилия.

Зажмите пинцетом сухожилие в месте разреза и отделите мышцу-сгибатель от ноги, аккуратно приподнимая ее. Чтобы обнажить нерв, идущий к мышце-разгибателю, перережьте основной нерв ноги в области лучезапястного сустава и осторожно отведите его назад, за мышцу-разгибатель. Отделение нерва мышцы-разгибателя от основного нерва ноги можно облегчить, осторожно потянув дистальный конец основного нерва ноги в сторону от препарата. При отведении основного нерва ноги назад за мышцу-разгибатель может потребоваться перерезать мелкие ветви тормозного аксона.

Нервный пучок можно визуализировать с помощью окрашивания метиленовым синим. Однако на данном верхнем изображении метиленовый синий не использовался для электрофизиологических записей. Красными стрелками отмечен интересующий нервный тракт.

Искомый нервный пучок представляет собой более крупный пучок, отходящий от основного нерва ноги рядом с проксимальным концом мерипода. Обратите внимание на разветвление аксонов и два отчетливо видимых аксона внутри нерва. После того как нерв и мышца стали доступны, подготовьте оборудование, используемое в эксперименте.

Внутриклеточная и внеклеточная регистрации проводятся с использованием стандартного головного модуля и усилителя. Мы используем усилитель Axon Clamp 2B и головной модуль 1XLU. Требуется три электрода: один внутриклеточный и два внеклеточных.

Два внеклеточных электрода будут использоваться для стимуляции нерва и регистрации вызванных синаптических и спонтанных событий. Выполните огневую полировку фокальных электродов и слегка согните их над нагревательным элементом. Заполнив фокальный электрод физиологическим раствором, поместите его в держатель стимулирующего электрода и вставьте провод стимулятора так, чтобы он контактировал с раствором.

Это устройство подключено к изоляционному блоку стимуляции grass P 15, который, в свою очередь, подключен к стимулятору S 88 grass. Во время электрофизиологических записей для визуализации аксонов используется витальный краситель D two ASP; для окрашивания аксонов замените солевой раствор в ванночке на раствор, содержащий 5 µM красителя four D two as per, на пять минут. Через пять минут снова заполните чашку физиологическим раствором для раков, поместите препарат под микроскоп и используйте объектив Forex.

При 10-кратном увеличении окуляра переместите стимулирующий электрод в интересующую область. Следующий шаг — поместить просвет макропатч-стимулирующего электрода на фазический или тонический аксон. На данной фотографии препарата, окрашенного двумя красителями, видно, что тонический аксон заметен более отчетливо благодаря повышенному содержанию митохондрий.

При флуоресцентной микроскопии видно, что тонические терминали имеют многочисленные варикозности, в то время как фазические терминали более тонкие. С помощью объектива 20x установите электрод либо на тонический, либо на фазический аксон. В данном случае электрод устанавливается на тонический аксон.

Поместите внутриклеточный электрод в микроманипулятор, затем введите внутриклеточный электрод в клетку мышцы-разгибателя. Это будет использоваться для регистрации внутриклеточных возбуждающих постсинаптических потенциалов или ВПСП. Для регистрации качественных ВПСП.

Поместите второй фокальный электрод в микроманипулятор. Для этого извлеките предыдущий внутриклеточный электрод вместе с держателем и замените его чистым держателем для электрода. С помощью микроманипулятора расположите просвет второго фокального электрода непосредственно над синаптическим варикозом.

Сопротивление электрода и плотного прилегания определяют путем пропускания тестовых импульсов тока через электрод. В наших экспериментах сопротивление плотного прилегания варьировалось от 0.3 до одного МОм, а сопротивление электрода — от 0.5 до одного МОм. Сопротивление плотного прилегания можно контролировать на протяжении всей записи.

Когда вы будете готовы начать стимуляцию, запустите программное обеспечение scope 5.0 и начните стимуляцию изолированного аксона. В нервном пучке тонический аксон стимулируется вакуумным электродом, а ЭПСП мышечного волокна регистрируются с помощью внутриклеточного или внеклеточного электрода. ЭПСП записываются на компьютер через интерфейс power lab forest.

После стимуляции тонического аксона стимулирующий электрод можно переместить на фазический аксон и повторить эксперимент после стимуляции нерва. Внутриклеточный электрод регистрирует ВПСП, возникающие в ответ на активность как тонических, так и фазических мотонейронов. Синаптическая фасилитация тонических нервно-мышечных соединений зависит от частоты стимуляции нерва, что показано здесь для последовательных серий примерно по 20 стимулов каждая при частоте 60 hertz.

Обратите внимание на облегчение, возникающее при многократной стимуляции. На этом рисунке сравниваются амплитуды ВПСП, вызванных стимуляцией тонического нерва с частотой 20 Гц (синим цветом), 40 Гц (зеленым цветом) и 60 Гц (красным цветом); отметьте выраженное облегчение, наблюдаемое при более высоких частотах стимуляции. Тонические терминали обладают низкой синаптической эффективностью, однако демонстрируют значительные облегченные ответы.

Здесь представлены только тонические ВПСП, а затем на тот же масштаб наложены фазические ответы. В отличие от тонических окончаний, фазические окончания обладают высокой квантовой эффективностью, однако при высокочастотной стимуляции демонстрируют синаптическую депрессию. Синаптическая депрессия в фазических окончаниях также зависит от частоты стимуляции, что показано здесь.

Непрерывная стимуляция с частотой 5 Гц в течение 30 минут подавляет ответ в нервно-мышечном соединении. При более высокой частоте стимуляции соответствующее воздействие приведет к более быстрому подавлению препарата. Нервно-мышечное соединение речного рака генерирует неспайковые ВПСП.

Эти ВПСП могут быть использованы для изучения квантовых свойств, которые формируют градуированные электрические сигналы в этих мышцах. Здесь представлены квантовые синаптические ответы тонического окончания. Обратите внимание, что не все сеансы стимуляции приводят к квантовому событию.

Прямой подсчет квантовых событий возможен при низкочастотной стимуляции для каждого вызванного ответа. Количество квантовых событий может быть легко определено для тонических терминалей. Путем подсчета квантовых событий синаптические ответы фазического мотонейрона могут быть зарегистрированы аналогичным образом.

Однако вызванные ответы имеют мультиквальный характер. Среднее квальное содержание оценивается по средней амплитуде или площади отклонений вместе со средней амплитудой или площадью пиков спонтанных событий. Последнее напоминание: будьте осторожны при удалении мышцы-сгибателя, чтобы не повредить нерв при подготовке мышцы-разгибателя.

На этом всё. Спасибо за просмотр и успехов в ваших экспериментах.