Моделирование биологических мембранах с плат и измерения электрических сигналов в Аксоны: Упражнения студенческой лаборатории

Общая цель данной процедуры — продемонстрировать, как биологические мембраны могут быть описаны с помощью электрических моделей, а также показать методику регистрации потенциалов действия в брюшном нервном стволе речного рака. Сначала в демонстрации используются компоненты электрической схемы на макетной плате для представления электрических свойств мембран. На втором этапе процедуры изменяются сопротивление и емкость в модельной схеме, чтобы изучить их влияние на кривые напряжения.

Третьим этапом процедуры является применение концепций, изученных на примере модельной схемы, к препарату живого нерва. Заключительный этап процедуры заключается в регистрации сложных потенциалов действия и изучении свойств пороговых рефрактерных периодов и синаптической передачи. В конечном итоге результаты показывают, что изучение моделей электрических цепей биологических мембран и свойств живых нервов может служить эффективным учебным инструментом, что подтверждается изменением компонентов модельной схемы и варьированием стимуляции живого нерва.

Данный метод позволяет понять, как биологические мембраны могут быть интерпретированы с точки зрения электрических моделей. Он также может быть применен к другим тканям, например, к мышечной ткани. Демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку препарирование брюшного нервного ствола и настройка системы регистрации поначалу могут вызвать затруднения; необходимо соблюдать осторожность, чтобы не повредить нервы для создания качественной системы стимуляции и регистрации сигналов с нервного ствола.

В первой части эксперимента резисторы и конденсаторы используются для моделирования электрической активности мембраны нервной клетки. В исходной схеме присутствуют только резисторы. Конденсаторы добавляются на последующем этапе.

Пассивные резистивные свойства нервной мембраны представлены схемой, показанной здесь. На макетной плате установлены параллельные резисторы с сопротивлением 33 kilo ohms, представляющие поперечное сопротивление мембраны, и последовательные резисторы с сопротивлением 10 kilo ohms, представляющие внутриклеточное сопротивление. В данной схеме предполагается, что сопротивление внешней жидкости ничтожно мало по сравнению с внутриклеточным и поперечным сопротивлениями мембраны.

После завершения сборки модели клетки подключите выходные провода лабораторного блока питания к макетной плате с моделью. Лабораторный блок питания генерирует стимулирующий сигнал и оснащен измерительным щупом для регистрации напряжения. Затем подключите лабораторный блок питания к компьютеру.

Компьютер используется для отображения электрических сигналов, регистрируемых с макетной платы. Следующим шагом является настройка программного обеспечения компьютера, которое будет управлять стимулом, подаваемым системой PowerLab на модель нервной клетки. Откройте программу LabChart с рабочего стола.

Выберите «Новый файл» (new file), затем «Настройка» (setup) и «Настройки каналов» (channel settings). Выберите канал для отображения, затем откройте панель стимулятора. Требуются длинные импульсы напряжением 1,5 volts.

Для этой части эксперимента установите амплитуду на один вольт. Лабораторный модуль питания будет подавать напряжение, колеблющееся между +0,5 и -0,5 вольтами, что обеспечит пиковый размах стимула в один вольт. Установите частоту на 0,75 гц, а длительность импульса — на одну секунду.

В настройках каналов выберите первый канал для мониторинга, нажмите на входной усилитель, в появившемся окне нажмите кнопку «дифференциальный», установите диапазон на пять вольт и подтвердите выбор. Следующий шаг — подача электрического сигнала на модель нервной клетки и изучение затухания сигнала по всей длине модели. Подайте напряжение на один конец цепи между точками A и B, нажав кнопку «старт» на компьютере.

Измерьте напряжение на первом единичном участке вдоль модели аксона и отслеживайте его на компьютере. Оставьте красный щуп измерителя напряжения неподвижным в точке A на макетной плате, перемещая другой щуп в разные точки между последовательно соединенными резисторами. Обратите внимание на падение напряжения в более удаленных точках.

Теперь прекратите запись, нажав кнопку остановки на компьютере. Измерьте сохраненные перепады напряжения на осциллограммах, хранящихся на компьютере, используя курсор для перемещения к каждому зафиксированному импульсу. Используйте курсор маркера M в левом нижнем углу, чтобы отметить нижнюю точку осциллограммы, и установите свободный курсор на пик осциллограммы для измерения разности напряжений.

Считайте значение разности напряжений с экрана и запишите его в лабораторный журнал для каждой точки измерения вдоль электрической цепи. Следующим шагом является расчет постоянной длины для модельной клетки, которая используется для описания экспоненциального затухания сигнала с расстоянием. Постройте график зависимости разности потенциалов от расстояния от источника, приняв расстояние между мембранными резисторами за одну единицу.

Помимо построения графика, определите постоянную длины данной цепи. Постоянная длины нервного волокна определяется как расстояние, на котором разность потенциалов на мембране снижается до 37% от ее первоначального значения в точке возникновения. Для более точного моделирования пассивных кабельных свойств нервных и мышечных волокон модель нервной клетки будет расширена и будет включать как резистивные, так и емкостные компоненты.

В мембране нервной клетки присутствует не только поперечное мембранное сопротивление, но и поверхностная емкость мембраны, которая искажает сигнал нервной клетки. Для моделирования этого эффекта подключите 10 конденсаторов емкостью 1 micro fert параллельно поперечной мембране. Резисторы на макетной плате на компьютере.

Настройте стимулятор на использование одного вольта в течение одной секунды, что соответствует амплитуде 0.5 volt и частоте импульсов 0.75 hertz. Также в правой верхней части панели установите скорость сбора данных на 20 K в секунду. Затем нажмите на канал один в правой части экрана.

Нажмите на входной усилитель в окне. Нажмите кнопку «дифференциальный» и установите диапазон на пять вольт. Нажмите «ОК».

Чтобы сохранить эти изменения, нажмите «start», чтобы начать сбор данных. Снимайте показания в одних и тех же точках на макетной плате. После сбора данных используйте окно масштабирования, чтобы увеличить время нарастания одного из прямоугольных импульсов.

Повторяйте увеличение по мере необходимости, чтобы растянуть график. Измерьте время, за которое сигнал поднимается от базовой линии до пика амплитуды напряжения, непосредственно перед тем, как он выйдет на плато.

Наблюдайте за временным течением изменения потенциала и искажением прямоугольных импульсов. Также отметьте, превышает ли измеренное напряжение 0.2 volts; используя курсор M и свободный курсор, как и ранее, определите изменение напряжения и запишите данные в тетрадь, приняв пороговое напряжение за 0.2 volts. Измерьте время, необходимое для достижения потенциалом порогового значения при каждом значении сопротивления мембраны.

Постройте график результатов, где время отложено по одной оси, а расстояние — по другой; увеличение толщины миелиновой оболочки приводит к снижению емкости мембраны. Смоделируйте этот процесс, заменив конденсаторы емкостью 10 micro ferd на макетной плате конденсаторами с меньшей емкостью 0.1 micro ferd. Повторите предыдущий эксперимент.

Отметьте изменение времени достижения порогового значения на выбранном резисторе. Наложите эти данные с более крупными конденсаторами на предыдущий график зависимости времени от расстояния. Увеличение толщины миелиновой оболочки позволяет электрическим сигналам нарастать и спадать быстрее в нервной клетке, что увеличивает скорость проведения.

В следующей части эксперимента будут изучены электрохимические свойства аксонов в брюшном нервном стволе речного рака. Свойства пассивного распространения тока, представленные в модельных схемах, наблюдаются и в живых препаратах. Однако для передачи сигнала на расстояние в несколько миллиметров необходим потенциал действия, так как пассивные электрические свойства клеток привели бы к затуханию сигналов на таком расстоянии.

Когда сигналы перемещаются по брюшному нервному канатику рака с разной скоростью проведения, сначала регистрируются самые быстрые, а затем, с небольшой задержкой, — более медленные. В зависимости от популяции аксонов с близкими скоростями проведения некоторые сигналы будут суммироваться при записи. Такой суммированный электрический сигнал от множества аксонов называется сложным потенциалом действия.

Следующая серия экспериментов посвящена регистрации суммарных потенциалов действия в нервах лангуста для получения вентрального нервного шнура. Сначала подготовьте инструменты для диссекции в чашке с нервами и физиологические растворы. Поместите лангуста на лед примерно на пять минут для анестезии.

После проведения анестезии оберните рака влажным бумажным полотенцем и зажмите его в одной руке, удерживая клешни большим и указательным пальцами. Другой рукой с помощью ножниц сделайте разрез через рострум между глазными впадинами. Режьте вниз от места разреза до полного отделения головы.

Удалите клешни и ходильные ноги. Сделайте разрез у основания головогруди над брюшком и отделите головогрудь. Удалите хвост и плавники.

Сделайте разрезы вдоль обеих сторон вентральной поверхности брюшка. Будьте осторожны, чтобы не повредить более глубокие ткани. Отогните освобожденный участок экзоскелета до основания хвостового веера, чтобы обнажить вентральный нервный шнур.

Используя край пинцета, осторожно удалите брюшной нервный канат, захватив его за кончик. Будьте осторожны, чтобы не растянуть и не раздавить нервный канат. Любые узлы, наблюдаемые на нервном канате, представляют собой ганглии рака.

Поместите нервный ствол на металлические перекладины в нервной камере. Крайне важно поддерживать влажность вентрального нервного ствола. Для этого добавьте в нервную камеру достаточное количество физиологического раствора для раков, чтобы уровень жидкости сравнялся с металлическими перекладинами.

Затем отпипетируйте такое количество физиологического раствора для речного рака, чтобы уровень жидкости едва касался нижней части перекладин. После размещения нервного ствола подсоедините к камере для нерва кабель стимулятора с двумя мини-крючками. Прикрепите положительный красный зажим к одной из внешних металлических петель у конца нервного ствола, а отрицательный черный зажим — к соседней металлической петле, которая также контактирует с нервным стволом.

С помощью манипулятора расположите вакуумный электрод рядом с концом нерва, напротив отрицательного и положительного выводов. Осторожно втяните кончик брюшного нервного ствола в регистрирующий электрод. Подключите электрод к зонду головного усилителя, соединив один провод вакуумного электрода с положительным входом зонда, а другой — с отрицательным входом.

Не имеет значения, какой провод подключается к какому входу. Зонд можно заземлить на клетке Фарадея или в солевом растворе с помощью хлорсеребряного провода, либо подключить его к заземляющему входу дифференциального усилителя для снижения потенциальных помех с частотой 60 Гц. Подключите зонд к дифференциальному усилителю, а усилитель — к системе PowerLab.

Проверьте настройки усилителя RS, указанные в таблице в сопроводительной статье. Используя USB-кабель, подключите PowerLab к компьютеру. Откройте программное обеспечение Scope на рабочем столе компьютера в верхней правой части экрана.

Выберите второй канал и выключите его. Отрегулируйте экран так, чтобы отображался только первый канал, перетащив разделительную полосу в центре вниз. Проверьте входной усилитель с параметрами, указанными в сопроводительной статье.

Затем в разделе настроек (setup) в верхней части экрана выберите стимулятор (stimulator), отключите изолированный стержень (isolated stem) и установите следующие параметры: задержка (delay) — 5 ms, длительность (duration) — 1 ms, количество импульсов — два, интервал — 15 ms, диапазон — 5 V и амплитуда — 0,5 V. Чтобы начать стимуляцию брюшного нервного ствола, нажмите кнопку старта (start) в левом нижнем углу экрана. В окне сбора данных осциллографа должен появиться четко выраженный потенциал действия.

Набросайте в своем блокноте общий вид потенциала действия. Медленно снижайте напряжение с помощью вкладки в верхнем левом углу экрана. Амплитуда потенциала действия должна уменьшаться до тех пор, пока его характерный волновой рисунок не исчезнет.

Снижение напряжения уменьшает количество нейронов, участвующих в формировании суммарного потенциала действия; чтобы обратить этот эффект, необходимо постепенно увеличивать напряжение. По мере привлечения большего числа нейронов амплитуда волны суммарного потенциала действия возрастает. Данное упражнение иллюстрирует тот факт, что отдельные нейроны имеют разные пороги возбуждения, при которых возникают их потенциалы действия.

Когда дальнейшее увеличение стимулирующего напряжения не приводит к росту суммарного потенциала действия, это означает, что все нейроны были задействованы, и на экране компьютера должны стать видны два отчетливых пика волны потенциала действия. Следующая часть эксперимента посвящена изучению рефрактерного периода аксонов. Измените интервал между импульсами с помощью вкладки в верхнем левом углу экрана.

Продолжайте сокращать интервал задержки до тех пор, пока не станет невозможно вызвать второй составной потенциал действия. Абсолютный рефрактерный период определяется как временная задержка между импульсами, при которой второй потенциал действия больше не возникает. Относительный рефрактерный период определяется как время от окончания абсолютного рефрактерного периода до момента, когда подача второго стимула приводит к возникновению второго потенциала действия с полной амплитудой.

Теперь вы можете изучить свойства ингибитора щелевых контактов, такого как гептетанол. Различия в сложном потенциале действия можно сравнить при одних и тех же настройках стимуляции, чтобы определить, какие сигналы передаются через щелевые контакты вдоль вентрального нервного ствола. Также можно использовать холодный или теплый физиологический раствор и измерить различия в скоростях проведения различных компонентов, составляющих сложный потенциал действия.

Здесь представлены два сложных потенциала действия, зарегистрированных в вентральном нервном шнуре речного рака. На данном рисунке проиллюстрирован относительный рефрактерный период — время после полного сложного потенциала действия, когда второй стимул вызывает более слабый сложный потенциал действия. На этом рисунке показано влияние применения гептана и этанола на сложный потенциал действия после проведения данной процедуры.

Компоненты схемы биологической мембраны могут быть изменены для поиска ответов на дополнительные вопросы, такие как влияние измененной плотности утечечных каналов в мембране или функция потенциалзависимых каналов после их разработки. Эти методы и процедуры открывают исследователям в области физиологии возможность изучить, как клетки функционируют в качестве электрических цепей и как работают щелевые контакты в живых тканях животных.