Выделение и В пробирке Активация Caenorhabditis Элеганс Сперма

Общей целью этой процедуры является визуализация морфологии сперматозоидов. Это достигается путем предварительной изоляции самцов для вскрытия за один день. Вторым этапом процедуры является препарирование самцов для выпуска спермы.

Третьим этапом процедуры является визуализация морфологии сперматозоидов. Заключительным этапом процедуры является подготовка сперматозоидов для последующего применения. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают морфологию сперматозоидов и способность к их активации при лечении активаторами in vitro.

Протокол выделения и активации сперматозоидов был впервые разработан более 30 лет назад Сэмом Уордом, Дайаной Шейкс и Грегори Нельсоном. В настоящее время мы используем эту процедуру для характеристики мутаций, которые изменяют функцию сперматозоидов и фертильность в C-элегантности. Общая цель этой процедуры заключается в визуализации CL elgan и морфологии сперматозоидов OID.

Это достигается путем изоляции самцов за день до вскрытия, чтобы они соблюдали целибат. Второй этап включает в себя препарирование самцов с целью высвобождения круглых немодальных сперматид. Третьим шагом является визуализация активации сперматид in vitro в соответствии с морфологией зрелых сперматозоидов AME.

Процедура будет продемонстрирована тремя постдокторантами в лаборатории, доктором Мэттом Марчелло, доктором и доктором Чаттерджи, а также доктором Гуной SLU для выделения сперматозоидов. Во-первых, получите большое количество самцов, скрещивая пять самцов дикого типа и одного гермафродита на небольшой лужайке кишечной палочки. OP 50 бактерии, сидящие в центре среды для роста нематоды или планшета NGM.

Примерно 50% следующего поколения будут самцами дикого типа для сбора. Самцы четырех стадий изучают стадию развития и морфологию хвоста под микроскопом. Четырехступенчатый червь типа L выбирается на основе морфологии хвоста.

У самца червя хвост округлый, а у гермафродита — заостренный хвост. Используя платиновую проволоку, выберите от 7 до 10 л четырехстадийных самцов за эксперимент и перенесите их в планшет NGM, засеянный OP 50, и дайте им расти в течение дня или двух. Выращивание безбрачных самцов в отсутствие гермафродитов предотвращает потерю сперматозоидов, и, таким образом, большое количество сперматозоидов будет доступно во время экспериментальной процедуры.

Перед началом вскрытия приготовьте один литр буфера M nine, используя шесть граммов гидрофосфата натрия DI, три грамма монокалийфосфата, пять граммов хлорида натрия, 0,25 грамма сульфата магния, hep для гидратации на литр и пять миллилитров сперматозоидной среды. В день вскрытия перенесите безбрачных самцов на пластину NGM без бактерий и дайте им ползать в течение нескольких минут. Этот этап помогает удалить небольшой слой кишечной палочки, прилипший к поверхности червей.

В качестве альтернативы можно насадить небольшой объем буфера M nine в часовое стекло и перенести в него папки. Далее, с помощью похлопывающей ручки, отметьте А. Маленький круг на стеклянной предметной трубке в объеме от 30 до 50 микролитров одной сперматозоидной среды внутри круга. Гидрофобный круг пера помогает удерживать сперматозоидную среду в пределах границы.

Пересадите от 5 до 10 самцов на сперматозоидную среду с помощью препарирующего эндоскопа. Держите один или два шприца в зависимости от уровня комфорта. С помощью игл 27 калибра на обеих руках используйте одну иглу, чтобы удерживать червя, а другой иглой разрезать задний конец самцов, чтобы выпустить сморщения.

Высвобождающиеся сперматиды видны в виде мельчайших гранул под стереомикроскопом. Однако иногда часть или большая часть сперматид может оставаться внутри туши. В этом случае осторожное перетаскивание туши по предметному стеклу может способствовать освобождению сперматид от туши.

Чтобы визуализировать активацию сперматид, препарируйте червей в одной сперматозоидной среде, содержащей P. Под микроскопом дайте червю постоять пять минут. Активированные сперматозоиды будут иметь псевдокапсулы. Аккуратно положите покровный листок на поверхность расчлененного образца.

Найдите поле сперматид при 100-кратном увеличении. Сперматиды имеют круглую форму. Пример DIC-изображения сперматид, выделенных из мужской C-элегантности, показан на рисунке 1.

Сперматиды имеют сферическую форму, а ядра выпуклые. Сперматозоиды, активированные in vitro, показаны на рисунке два, сперматозоиды имеют заметную псевдоструну. При необходимости от 80 до 95% сперматид превращаются в сперматозоиды.

Заключительным этапом процедуры может быть подготовка сперматозоидов для последующего применения. Например, сперматозоиды могут быть зафиксированы для иммунофлюоресценции. В конечном счете, полученные результаты могут показать способность активировать сперматозоиды in vitro и анализировать морфологию сперматозоидов.