Выделение головного и спинного мозга одноядерных клеток Использование Перколла Градиенты

Иммунные клетки проникают в центральную нервную систему во время инфекции, травмы, аутоиммунных заболеваний или нейродегенерации. В то время как гистохимические подходы могут быть использованы для определения местоположения инфильтрирующих клеток и анализа связанной с ними патологии, эти методы ограничены количеством антител, которые можно использовать одновременно. Здесь показан метод быстрого выделения мононуклеарных клеток из тканей головного и спинного мозга, при котором рассеченная ткань сначала гомогенизируется.

Затем устанавливается перольный градиент, и после центрифугирования мононуклеарные ячейки собираются из интерфейса. Наконец, клетки промывают и окрашивают антителами С помощью анализа проточной цитометрии различают гематогенные клетки и микроглию наблюдения, а также можно определить их относительные пропорции во время болезненных состояний. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как градиент Ариса или в такой гистохимии, заключается в том, что она менее трудоемка.

Это позволяет обрабатывать больше тканей одновременно. Демонстрировать установку градиента будет палино: Техник из моей лаборатории: Подготовьте реагенты, которые понадобятся для этого протокола. Начиная с четырех миллилитров изотонического перола, называемого SIP на мозг.

Для этого соедините девять частей перола с одной частью 10 раз HBSS без кальция и магния, смешанных путем инверсии. Далее приготовьте 70% на звонок, смешивая приготовленный сип с одноразовым HBSS без кальция и магния. Затем выдайте два миллилитра 70% на колу в полипропиленовую коническую трубку объемом 15 миллилитров для сбора ткани.

Для этой процедуры расчлененные головной и спинной мозги всех исследуемых мышей помещают в стаканы, содержащие 10 миллилитров RPMI, над льдом. Затем переложите ткань в гомогенизатор объемом 7 или 15 миллилитров, содержащий три миллилитра одного HBSS свободного размера. С помощью пестика аккуратно сделайте клеточную суспензию, затем переключитесь на плотно прилегающий пестик размера В, и еще больше диссоциируйте ткани.

После того, как ткань будет гомогенизирована, добавьте RPMI или однократный HBSS до конечного объема в семь миллилитров и приступайте к настройке градиента для создания градиента percoco. Начните с добавления трех миллилитров SIP в клеточную суспензию до конечной концентрации PERCOCO 30%. Имейте в виду, что перол следует использовать при комнатной температуре. Если его использовать в холодном виде, клетки имеют тенденцию слипаться, и разделение клеток менее эффективно.

Затем, используя наш пипеточный аппарат для настройки режима гравитации, медленно нанесите 10-миллилитровую суспензию ячеек поверх 70% SIP. Избегайте смешивания 70% и 30% растворов. Это самый ответственный этап процедуры.

Очень четкая ровная линия должна быть видна на перекрестке от 70 до 30%. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности, потому что третий и 70% растворов будут смешиваться во время расслоения. Следующий шаг, компрометация интерфейса центрифуги 30 минут 500 Gs при 18 градусах Цельсия.

Убедитесь, что центрифуга остановится с минимальным перерывом или без него, чтобы не нарушить работу интерфейса. После вращения градиентов в верхней части трубки должен скапливаться толстый и вязкий слой мусора. Следующий слой – это желтоватый слой 30% на ядро, который иногда содержит мусор.

Далее идет интерфейс 70 на 30, который должен иметь определенный белый ореол и содержать мононуклеарные ячейки. Наконец, на дне пробирки находится прозрачный слой с содержанием перола 70%. Если граница раздела не наблюдается, выход ячеек, вероятно, будет очень низким, что делает дальнейший анализ чрезвычайно сложным.

Таким образом, на этом этапе могут потребоваться свежие клеточные суспензии для снижения контаминации. Осторожно снимите слой мусора с верхней части трубки и выбросьте его. Затем с помощью пластиковой пипетки пройдитесь по верхнему 30%-ному стержневому слою и соберите два-три миллилитра промежуточной фазы 70-30 и перенесите его в чистую коническую пробирку, содержащую восемь миллилитров одноразового HBSS.

Несколько раз перемешайте разбавленные границы путем инверсии, затем центрифугируйте в течение семи минут при 500 GS при 18 градусах Цельсия. После отжима извлеките супину и снова суспендируйте гранулу. В один миллилитр буфера для окрашивания клеток переложите клеточную суспензию в тюбик объемом 1,5 миллилитра и промойте ее еще раз.

Используя микроцентрифугу при 10 000 GS в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия, прежде чем приступить к окрашиванию антителами, повторно суспендируйте гранулы в 50 микролитрах очищенного анти-US CD 16, CD 32, разведенного от одного до 200 в буфере для окрашивания клеток, чтобы блокировать сайты связывания FC. Как и при любой процедуре окрашивания, крайне важно, чтобы все антитела были адекватно титрованы и инкубированы на льду в течение 10 минут. Во время инкубации удалите от двух до пяти микролитров клеток и подсчитайте их с помощью гемоцитометра.

Объединенные наивные ткани головного и спинного мозга должны давать от трех до пяти умножить на 10-5 клеток на мышь. Воспаленный мозг будет иметь различное количество воспалительных клеток в зависимости от момента их сбора и модели заболевания После инкубации с CD 16 и CD 32 добавьте 50 микролитров смеси коктейлей антител, специфичных для иммунных клеток. Смесь, используемая в данном примере, содержит антитела против CD 45, CD 4 и CD 19, которые инкубируются на льду в течение 30 минут.

Важно отметить, что каждое антитело должно быть сначала титровано. Чтобы оценить оптимальное разбавление, используйте соответствующие комбинации флуорохромов, подобранные в соответствии с возможностями лазера и настройками фильтра вашего конкретного потока. Цитометр, после окрашивания клеток, промойте их в буфере для окрашивания клеток, добавив один миллилитр буфера для окрашивания клеток и вращая их в течение одной минуты.

При 10 000 G после отжима выбросьте лежачий агент, затем повторно суспендируйте поддоны в 100-200 микролитрах буфера для окрашивания клеток для немедленного проточного цитометрического анализа для последующего анализа. Ройс суспендирует клетки в формальдегиде с содержанием 2% пара, приготовленном в PBS, и хранит в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия. Здесь показаны мононуклеарные клетки, полученные и инкубированные с блоком FC, за которыми следуют антитела против CD 45, CD 4 и антитела к CD 19.

В соответствии с продемонстрированным протоколом методом проточной цитометрии окрашивание CD 45 хорошо отделяет высокогематогенные клетки CD 45 от CD 45, микроглии наблюдения DIM. На этом рисунке сравниваются клетки, выделенные у наивных, и воспаленный мозг мыши, вызванной для развития экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита. CD 45 A Интенсивность ПК показана на оси Y, где в наивном мозге визуализируются три различные популяции.

Обнаруживается очень небольшое количество клеток высокого уровня CD 45. Обычно менее 2% от общего числа изолированного населения. Для сравнения, мозг мышей, пораженных EAE, демонстрирует массовый приток клеток крови, рекрутируемых в мозг.

Добавление других маркеров клеточной поверхности, таких как CD 11 b, CD 4, CD 8 и т.д., позволяет дополнительно охарактеризовать высокую популяцию CD 45 После освоения этот метод может быть выполнен за три-четыре часа, если он выполнен правильно. При проведении этой процедуры важно помнить, что гистологические подходы в сочетании с иммунным фенотипированием методом проточной цитометрии имеют решающее значение для полной характеристики состава воспалительных инфильтратов ЦНС.