Мониторинг Иммунные клетки торговли Флуоресцентный Прион стержни часов после внутрибрюшинного инфекции

Основная цель данной процедуры заключается в мониторинге поглощения и транспорта прионов иммунными клетками в течение нескольких часов после инфицирования. Сначала необходимо очистить и пометить флуорохромом агрегированные прионные стержни из инфицированного мозга, затем ввести эти прионные стержни в брюшную полость мышей. Через два часа следует собрать клетки из брюшины, селезенки, а также из средопозвоночных и брыжеечных лимфатических узлов. В завершение окрасьте полученные клетки иммунофенотипическими маркерами и проанализируйте их на предмет задержки PreOn.

Например, результаты проточной цитометрии могут быть использованы для того, чтобы показать, что прионные стержни удерживаются и транспортируются преимущественно макрофагами и дендритными клетками, во вторую очередь моноцитами и в третью — B-клетками. Данная экспериментальная система разработана для прояснения природы резервуаров прионов и поиска потенциальных терапевтических мишеней путем поиска ответов на ключевые вопросы, такие как: какие клетки захватывают PreOn сразу после инфицирования? Куда они их переносят и с какой скоростью?

Эту процедуру продемонстрируют Кристал Мт. и Брэди Майкл, аспиранты моей лаборатории, с целью выделения белков PreOn. Гомогенизируйте 100 milligrams ткани мозга, инфицированной PreOn, в 900 milliliters ледяного гомогенизирующего буфера в течение одной минуты на максимальной скорости в коммерческом блендере, после чего немедленно поместите образец на лед на две минуты. Повторите этот процесс трижды для увеличения выхода белка.

Центрифугируйте гомогенат в течение 10 минут при 3000 Gs и температуре четыре градуса Цельсия. Соберите супернатант и храните его на льду. Ресуспендируйте осадок в одном литре hp и повторите этапы гомогенизации и центрифугирования.

Теперь объедините супернатанты и центрифугируйте в течение 60 минут при 100, 000 g и 0 °C. Удалите супернатант. Ресуспендируйте осадок в 100 мл TBST.

Определите концентрацию белка с помощью метода Брэдфорд и доведите объем до 5 mg/mL белка в буфере TBST. Охлаждайте на льду в течение 30 минут. Снова центрифугируйте в течение 30 минут при 100 000 ×g и 0 °C.

Удалите супернатант и промойте осадок сначала 50 миллилитрами TBST. Затем ресуспендируйте полученный осадок в 100 миллилитрах 1X PBS, содержащего 1% sarcas seal и коктейль ингибиторов протеаз, и перемешивайте в течение 120 минут при 37 °C. Для проведения центрифугирования в градиенте сахарозы нанесите образец слоем на 900 миллилитров 320 миллимолярной сахарозы и центрифугируйте в течение 60 минут.

Центрифугируйте при 100 000 g при 10 °C. Удалите супернатант и ресуспендируйте осадок в 10 мл 2,3 М раствора хлорида натрия с добавлением 5% Sarco seal. Затем подвергните образец ультразвуковой обработке пять раз по 40 секунд при 70% максимальной мощности с интервалами в одну минуту.

Перенесите 1 мл образца в пробирки Eppendorf и центрифугируйте в течение 15 минут при 13 000 ×g и 4 °C. Дважды промойте осадки буфером TBS и храните стоки при -70 °C. Конъюгируйте одну пробирку очищенных стержней PreOn, используя один флакон флуорохрома DITE 649, согласно протоколу производителя.

Наконец, замените буфер для окрашивания дитом на PBS путем центрифугирования через фильтрующие колонки. Храните в аликвотах по 20 µL при температуре -70 °C в защищенном от света месте до момента использования. Этот раздел охватывает внутрибрюшинное введение прионов, инокуляцию и выделение клеток из брюшины, средопосреднических и брыжеечных лимфатических узлов, а также селезенки непосредственно перед использованием флуоресцентного приона D-петли.

Зафиксируйте мышь, захватив кожу в области загривка большим и указательным пальцами. Осторожно поверните мышь мордой к себе и зафиксируйте хвост мизинцем. Положите мышь на спину, приподняв заднюю часть туловища над головой и удерживая ее в слегка перевернутом состоянии.

С помощью инсулинового шприца с иглой 30G введите 100 µL флуоресцентных стержней pion на расстоянии одного сантиметра латеральнее срединной линии и одного-двух сантиметров антериорнее крестцово-подвздошного сустава. Введите иглу на один сантиметр через кожу под углом 45 градусов в медиальном направлении; для контрольных мышей используйте разведение флуоресцентных микросфер 1:50 или только PBS. В соответствии с планом эксперимента, инкубируйте мышей в течение установленного времени перед началом анализа.

Проведите эвтаназию мышей в соответствии с утвержденными протоколами комитета по уходу и использованию животных. Введите 10 milliliters PBS в брюшную полость, используя шприц объемом 12 milliliter и иглу 25 gauge. Осторожно покачивайте мышь в продольном направлении в течение одной минуты, после чего приступайте к диссекции мыши.

Тщательно смочите вентральную сторону шерсти мыши 70% ethanol. С помощью пинцета приподнимите кожу по срединной линии чуть ниже грудной клетки и сделайте небольшим ножницами разрез кожи. Выполните разрез кожи длиной от трех до пяти сантиметров в обоих направлениях — к голове и к хвосту.

Сделайте два разреза длиной по 2 см от средней линии латерально с каждого конца, отложите и зафиксируйте кожу булавками, чтобы открыть брюшную и грудную полости. Соберите суспензию клеток из брюшины, используя тот же шприц и иглу 16 G. Перенесите экссудат в коническую пробирку объемом 15 мл и храните на льду.

Осторожно прорежьте тонкую полупрозрачную мембрану, окружающую брюшину, и раздвиньте ткани грудной клетки, чтобы обнажить средостение. Теперь найдите и удалите от двух до четырех лимфатических узлов средостения, расположенных чуть дорсальнее и латеральнее тимуса, медиальнее плечеголовной артерии рядом с вентральной стороной трахеи. Затем найдите и удалите до шести брыжеечных лимфатических узлов, встроенных в мягкую белую ткань брыжейки, которая фиксирует кишечник к задней брюшной стенке.

Поместите лимфатические узлы в один миллилитр среды PMI 1640 на льду до завершения препарирования. В завершение найдите и извлеките селезенку — продолговатый темно-красный орган, расположенный латеральнее срединной линии и дорсальнее кишечника с левой стороны мыши.

Используя поршень одномиллилитрового шприца, измельчите и пропустите лимфатические узлы через сито с ячеями 40 мкм в три миллилитра PBS в пластической чашке Петри. Промойте сито еще двумя миллилитрами PBS и перенесите полученную клеточную суспензию общим объемом пять миллилитров в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. Также промойте чашку Петри еще пятью миллилитрами PBS и перенесите жидкость в ту же пробирку.

Центрифугируйте образец в течение пяти минут при 250 gs. Удалите супернатант и ресуспендируйте клеточный осадок. В 1 мл буфера fax перенесите изолированные клетки в пробирку EOR объемом 1.5 мл.

Как правило, данный протокол окрашивания может быть использован для идентификации субпопуляций иммунных клеток с помощью флуоресцентных антител к хорошо изученным поверхностным маркерам иммунных клеток. Добавьте все антитела в буфер FACS непосредственно перед использованием. Подсчитайте количество клеток и распределите 10⁶ клеток по микроцентрифужным пробиркам, осадите клетки центрифугированием и промойте осадок дважды 1 мл буфера FACS для блокирования эндогенных FC-рецепторов.

Инкубируйте клетки в 100 µL раствора антител крысы anti-US CD 1632 в концентрации 2 ng/mL в течение 20 минут на льду, затем центрифугируйте для получения осадка и промойте клетки буфером FACS. Затем добавьте к каждому образцу 100 µL соответствующего флуоресцентного антитела или антител в концентрации 1 ng/mL и инкубируйте на льду в течение одного часа. К контрольным клеткам добавьте только 100 µL буфера FACS, затем центрифугируйте и промойте клетки дважды буфером FACS.

Ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера ACT, инкубируйте на льду в течение одной минуты. Чтобы лизировать эритроциты, центрифугируйте клетки до получения осадка и промойте их буфером FAX, затем ресуспендируйте клетки в 1 мл буфера FAX. Проанализируйте образцы на проточном цитометре, обычно оснащенном лазерами возбуждения с длиной волны 405, 488 и 633 нм и от 5 до 10 детекторами флуоресцентного излучения.

Грубый прионный, инфицированный гомогенат мозга значительно обогащен прионами. Процесс очистки включает использование детергента, сольватацию и ультрацентрифугирование гомогената мозга лося E two. Конечным продуктом является протеаза.

Анализ специфических популяций клеток методом проточной цитометрии показывает, что антигенпрезентирующие клетки мигрируют в брюшину к двум часам и удерживают флуоресцентные микросферы и прионные стержни. Клетки мышей, которым вводили микросферы и прионы, проявляли значительную флуоресценцию, особенно моноциты, дендритные клетки и макрофаги.

Моноциты, дендритные клетки и макрофаги, несущие PreOn, также были обнаружены в средостениальных лимфатических узлах. Через два часа после инокуляции в ротовых или брыжеечных лимфатических узлах бусинок или стержней PreOn обнаружено не было. В данном эксперименте на видео продемонстрировано несколько протоколов: очистка агрегированных прионных стержней из инфицированного мозга для проведения внутрибрюшинных инъекций, правильное определение и выделение лимфатических узлов и, наконец, выделение и окрашивание иммунных клеток.