Пептидов из библиотеки Показать Фаг Модуляция экспрессии генов в клетки и мезенхимальные Потенцирует остеогенез в Unicortical костных дефектов

Общая цель этого эксперимента — выявить последовательности, которые потенцируют дифференцировку мезенхимальных клеток и способствуют восстановлению кости. Первым шагом является выделение с помощью биопа фага, который связывается с костью. Приступайте к выявлению пептидных последовательностей, которые связываются с мезенхимальными клетками, а также определяйте последующие изменения экспрессии генов.

Проведите эксперименты, чтобы определить, как пептидные последовательности могут быть доставлены в кости в регенеративных целях. В качестве заключительного шага изучайте восстановление кости гистологически вместе с результатами, которые могут дать важное представление о механизмах дифференцировки клеток in vitro и восстановления кости in vivo. Преимущества использования метода биоп-панорамирования с библиотекой фагового дисплея заключаются в том, что мы смогли идентифицировать пептиды, которые нацелены на кость и могут быть использованы для стимуляции дифференцировки мезенхимальных клеток и потенцирования костной ткани.

В конечном счете, эти пептидные последовательности могут быть полезны в терапевтических методах восстановления костной ткани и для лечения потери костной массы, таких как остеопения и остеопороз. Основываясь на исследовании, в котором ULA и Pascal показали, что биопсерфинг может быть использован для выделения пептидных последовательностей, нацеленных на кровеносные сосуды, мы решили адаптировать этот метод к механизмам опроса в костях. Для процедуры биопа in vivo перфузировали 10 раз по 10 до 10-й бляшки, выполняющей единицы библиотеки пептидов фагового дисплея N-E-B-P-H-D 12 через сердце 10-недельной мыши с клапаном С.

Примерно через пять минут усыпьте мышь, обнажите и рассеките бедренные кости, отрежьте концы и удалите костный мозг. Промойте левую бедренную кость изнутри и снаружи PBS 10 раз. Затем добавьте косточку к ER 2 5 3 7 бактерий.

Для того чтобы удалить несвязанный фаг, с помощью 2% сухого обезжиренного молока в шприце с иглой 21 калибра промыть промежуточный канал правой бедренной кости 10 раз. Теперь вымывайте связанный фаг из промежуточного канала с помощью соляной кислоты глицинового буфера. pH 2,2 нейтрализован одним mo la triss.

Чтобы амплифицировать фаг, добавьте ЭИТ к ER 2 5 3 7 бактерий и культивируйте в течение 4,5 часов. Осторожно переложите надосадочную жидкость в свежие пробирки и трижды осадите фаг путем добавления полиэтиленгликоля. Раствор хлорида натрия, инкубировать в трубках в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия.

Наконец, повторно суспендируйте гранулу в TBS с 0,02% азидом натрия. Нанесите фаг на планшеты, чтобы определить единицы, образующие бляшки амплифицированных ЭИТ. Повторите процедуру биопанорамирования in vivo для ускользнувшего и неэлюированного фага четыре раза.

Амплифицируйте объединенный фаг в бактериальных культурах. Очистите и количественно оцените последовательность ДНК, окончательную фаговую ДНК с использованием праймера 98, входящего в комплект для фагового дисплея. Важно рассчитать частоту репрезентации последовательности ДНК фага.

Теперь синтезируйте пептиды, включающие глицинглицин глицин и семена лизина и амплифицируйте клетки Done. Клонированная мышиная мультипотенциальная стромальная клеточная линия костного мозга, которая была разработана в нашей лаборатории при 90% конфлюенции. Трипсин представляет собой клетки и центрифугу для гранулирования и подсчета для пептидного окрашивания пластин клеток на камере, покрытой желатином, камерных хорошо предметных стеклах и культивировании в течение 24 часов.

Промойте клетки PBS и зафиксируйте 4%-ным паральдегидом на 30 минут. Теперь проведите блокирующие инкубации с глицином, а затем BSA Aden и BBSA. Растворы для блокирования биотина.

Добавьте 100 микромоляров биотинилированных пептидов L-7 и R-1. Приступайте к промывке клеток трижды с PBS по пять минут каждая. Добавьте один к 1000 разбавляйте стриппин крышкой и фольгой и выдерживайте в темном ящике в течение 30 минут.

Промойте элементы и накладки крышки крепления с помощью монтажного носителя Vector Shield. Теперь проанализируйте предметные стекла под флуоресцентным микроскопом за 24 часа до операции. Замочите баллоны с гелевой пеной.

Переведите баллоны с гелевой пеной с 20 микромолярным пептидом либо L 7, либо R one, либо PBS буфером без пептида в стерильный 12. Хорошо культивируют посуду и ставят в холодильник на ночь при температуре четыре градуса Цельсия на момент операции. Поместите гелевый композит для телефона на лед до использования.

С помощью пневматического жернова под солевым раствором создают большой продолговатый однокорковый дефект шириной три миллиметра и длиной восемь миллиметров. Обработайте костный дефект подготовленными гелевыми пенами, вставив все имплантированные каркасы с помощью мягкого постукивания. Усыпьте крыс и соберите большеберцовую кость в определенные моменты времени, тщательно проверьте наличие костного дефекта и закрепите собранную голень в 10% нейтральном буферном формалине для парафинового среза.

Наконец, окрасьте все участки ткани гематином эозином, чтобы пометить остеоматрикс. Флуоресцеин изотиоцианат, меченный Аденом, позволяет микроскопически обнаруживать связывание пептидов на клетках, выращенных in vitro. Здесь пептиды связываются с мезенхимальными клетками в культуре для определения остеогенного действия пептидов на клетки.

Мезенхимальные клетки in vitro в культуре могут быть обработаны тестовыми пептидами для определения изменений в морфологии клеток. Например, на четвертый день клетки начинают агрегировать, а агрегаты со временем увеличиваются, образуя узелки. Интересно, что костный срез окрашивается в автофлуоресценцию h и e под воздействием ультрафиолетового света.

Этот больший контраст между костными и некостными тканями облегчает количественную оценку наличия кости в срезах для определения восстановления кости в дефектах, обработанных гельпеной плюс пептидом. По сравнению с гельпеной, дефекты, которые были заполнены плюсовым пептидом, показали наибольший объем кортикального восстановления со временем при попытке этой процедуры. Важно быть предельно методичным при вводе данных из-за большого количества образцов, которые неизменно будут накапливаться в течение долгого времени, пока вы не выберете окончательную группу пептидов.

Разработка биопа in vivo в качестве метода идентификации пептидов, нацеленных на кость, означает, что теперь у нас есть потенциальные препараты, которые могут быть использованы в качестве терапии для восстановления костной ткани и ее потери. Один из механизмов, лежащих в основе восстановления костной ткани, также участвует в потере костной массы. Более подробное понимание этих механизмов и наличие инструментов, которые могут быть использованы для лечения таких заболеваний, как отсроченные переломы и остеопороз, поможет улучшить методы лечения, которые могут быть разработаны для здравоохранения.