Протокол по производству Генетические Креста Паразиты грызунов малярией

Общая цель данной процедуры заключается в проведении генетического скрещивания паразита малярии грызунов plasmodium yoi для получения рекомбинантного потомства. Это достигается путем первоначального введения группе мышей смешанного инокулята, содержащего два родительских клона паразитов, подлежащих скрещиванию. Затем инфицированные мыши используются для кормления комаров, внутри которых гаметы каждого родительского штамма сливаются в диплоидную зиготу; мейотическое деление на этом этапе может привести к генетической рекомбинации, что в итоге дает рекомбинантное потомство.

Полученные спорозоиты затем собирают из слюнных желез комаров и повторно вводят наивным мышам-реципиентам для получения паразитов кровяной стадии, среди которых находятся отдельные рекомбинантные клоны, которые можно выделить методом лимитирующего разведения. В успешном эксперименте от 5 до 10% клонированных линий окажутся рекомбинантами, которые можно охарактеризовать путем генотипирования по соответствующим генетическим маркерам. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области исследований малярии, такие как: каковы генетические детерминанты лекарственной устойчивости и трансмиссивности малярии?

Паразиты. При комнатной температуре подготовьте два флакона с замороженной кровью, содержащей малярийных паразитов для скрещивания. В данном примере используются два штамма малярии грызунов: Plasmodium yoelii и Plasmodium berghei. С помощью шприца с иглой калибра 22–30 наберите 400 µL PBS pH 7.4, используя тот же шприц.

Наберите 100 µL крови, инфицированной Thor, и несколько раз переверните шприц вверх-вниз до достижения однородности смеси. В данной демонстрации будут использоваться анестезированные животные с целью минимизации боли и стресса. Анестезия проводится путем введения в брюшную полость мыши 50 µL коктейля из анестетиков, содержащего 82.5 mg/kg кетамина и 7.5 mg/kg ксилазина.

Следите за глубиной анестезии мышей, чтобы предотвратить летальный исход. При использовании данной процедуры мыши будут находиться под воздействием анестетика от 20 до 30 минут. Перед выходом из наркоза введите 200 µL раствора, содержащего паразитов, непосредственно в брюшину мыши.

По завершении утилизируйте шприц в контейнере для острых предметов. Используя этот метод, через три-пять дней после инъекций заразите двух мышей каждым из двух штаммов паразитов, которые подлежат скрещиванию. У зараженных мышей разовьются паразиты кровяной стадии.

Стерильными ножницами отсеките кончик хвоста мышей-доноров, инфицированных различными штаммами паразитов. Соберите каплю крови из хвоста мыши на предметное стекло и приготовьте тонкие мазки. Окрасьте тонкий мазок крови красителем Гийема.

Краситель Гийлема SA не окрашивает неинфицированные эритроциты из-за отсутствия в них ядра; SAI окрашивает ядра паразитов в инфицированных эритроцитах. Паразиты в эритроцитах определяются в виде кольцевидных стадий, трофозоитов и разрывающих клетки шизонтов. Как только уровень паразитемии у обеих групп мышей достигает 1–5%, паразиты стадии развития в крови могут быть собраны для создания смешанной клональной инфекции.

Обрежьте кончик хвоста мышей-доноров, зараженных различными паразитами, используя стерильные ножницы, как было описано ранее. Соберите 1 µL крови из хвоста мыши с помощью стеклянного капилляра в 1 mL стерильного PBS. Используйте 20 µL этой суспензии крови для анализа плотности эритроцитов с помощью системы CellOMe.

Используя данные о плотности и параметрах эритроцитов, разведите образцы крови в физиологическом цитратном солевом растворе таким образом, чтобы получить концентрацию инфицированных эритроцитов 1 миллион на 100 µL. Смешайте образцы инфицированной крови двух доноров в соотношении один к одному для получения инокулята смешанного клона. Затем введите 100 µL смешанного образца в брюшную полость каждой мыши, предназначенной для инфицирования.

Для инфицирования одиночными клонами используйте двух мышей, чтобы подтвердить успешную передачу каждого родительского штамма. Половые стадии паразита, называемые мужскими и женскими гаметоцитами, должны начать появляться в крови мышей примерно через четыре дня после инфицирования. Начиная с этого момента, ежедневно контролируйте появление гаметоцитов, собирая кровь из хвоста, как описано ранее, и подготавливая тонкие мазки крови из хвоста.

Самцов и самок цитов можно распознать по наличию крупных гранул или пигментов. Цитоплазма мужских gato sites имеет розовый цвет, тогда как цитоплазма женских TER sites — синий. Только зрелые gato sites имеют крупную вакуоль.

После обнаружения зрелых цистоидов обоих полов мышей можно использовать для кормления комаров. Введите 50 µL раствора кетамина, ксилазина и анестетика в брюшину каждой инфицированной мыши. После того как мыши будут анестезированы, поместите одну из них животом вверх на верхнюю часть клетки, содержащей от 50 до 100 самок комаров Anis defense enzyme, которые были лишены источника сахара в течение 24 часов, и позвольте комарам беспрепятственно питаться в течение 30 минут.

Гуманно эвтаназируйте мышей сразу после периода кормления. При успешной передаче через девять дней после кормления гаметоциты, поглощенные комарами, сольются в диплоидные зиготы, которые созреют в ооцисты, видимые в средней кишке насекомых. Чем больше ооцист будет обнаружено, тем выше вероятность образования рекомбинантных паразитов.

С помощью аспиратора соберите от 5 до 10 инфицированных комаров из клетки и перенесите их в небольшой контейнер. Анестезируйте комаров углекислым газом и перенесите их в стеклянную чашку Петри на льду. Самцов, чьи усики заметно более густые, чем у самок, следует удалить.

Заполните два шприца PBS и оснастите их иглами калибра 26 длиной полдюйма. Нанесите около 100 µl PBS из шприца на предметное стекло. С помощью игл перенесите от пяти до 10 анестезированных самок комаров в каплю PBS и поместите стекло под диссекционный микроскоп.

Удалите крылья и ноги каждого комара, затем зажмите насекомое в области груди и задней части брюшка. Разорвите тело до тех пор, пока не освободится средняя кишка, представляющая собой белое мешковидное тело. Отделите среднюю кишку и в процессе препарирования удалите остальную часть тела.

Обязательно поддерживайте средние отделы кишечника во влажном состоянии, используя PBS из диссекционных игл. После завершения диссекции накройте средние отделы кишечника покровным стеклом. Изучите средние отделы кишечника под световым микроскопом при 100-кратном увеличении.

OOS будут распознаваемы как толстостенные циркулярные структуры, расположенные на внешней поверхности средней кишки. Подсчитайте количество OOS в каждой средней кишке. Через 17 дней после кормления спорозоиты, высвободившиеся из OOS, должны мигрировать в слюнные железы комаров; спорозоиты малярийных паразитов.

Тонкие веретенообразные клетки для сбора sporozoites. Сначала подготовьте пробирку для сбора с помощью чистых ножниц. Отрежьте крышку маленькой пробирки einor объемом 500 µL.

Нагрейте кончик стерильной иглы 19 gauge и проколите дно пробирки. Заполните одну треть пробирки стеклянной ватой для создания фильтра. Поместите пробирку-фильтр внутрь более крупной пробирки типа еппендорф объемом 1,5 milliliter.

После того как фильтрационный аппарат будет готов, соберите и анестезируйте комаров, как было описано ранее. Закрепите насекомых для диссекции, как и прежде, и удалите головы, крылья, ноги и брюшки комаров. Только в грудном отделе находятся инфицированные слюнные железы.

С помощью тонкого пинцета перенесите грудной отдел в гомогенизатор объемом 1,5 миллилитра, содержащий 500 µL PBS. Гомогенизируйте грудной отдел на льду, чтобы высвободить спорозоиты из слюнных желез, и с помощью стеклянной пипетки перенесите гомогенаты в фильтрационный аппарат. Центрифугируйте фильтр-трубку в течение 10–20 секунд при 1000 об/мин.

После центрифугирования гомогенатов соберите супернатант с помощью шприца, оснащенного иглой калибра 22–30 G. Введите от 100 до 500 µL суспензии спорозоитов в брюшину мыши. Начните мониторинг плотности паразитов и эритроцитов в крови мышей через три дня после инфицирования.

В качестве донора для процедуры клонирования выберите мышь с уровнем паразитемии от 0,1 до 1%, в инфицированных эритроцитах которой содержатся преимущественно одиночные паразиты. Возьмите необходимое количество крови из хвоста мыши в PBS, разбавьте ее в холодном растворе сыворотки теленка и раствора Рингера для млекопитающих в соотношении один к одному, чтобы достичь концентрации от 0,6 до 1 инфицированного эритроцита на 100 µL, и храните инокулят на льду. Очистите место внутривенной инъекции в хвосте этиловым спиртом.

Введите по 100 µL разведенной инфицированной крови каждому из 100 мышей. Таким образом, каждая отдельная мышь должна получить либо одного, либо ноль паразитов. При успешном проведении эксперимента у 20–50% мышей к восьмому дню уровень паразитемии составит от 0,1 до 0,5%.

Через пять-семь дней проведите скрининг мышей на наличие паразитов на стадии развития в крови, исследовав тонкие мазки крови, зафиксированные гематином. Потомство паразитов, полученное в результате скрещивания, затем можно генотипировать с помощью ПЦР ДНК, выделенной из образцов крови из хвоста, используя генетические маркеры на разных хромосомах, такие как микросателлиты и однонуклеотидные полиморфизмы. Рекомбинантными клонами считаются паразиты, чьи независимые генетические локусы происходят от двух родительских клонов.

Кровь животных, зараженных рекомбинантными паразитами, можно криоконсервировать для дальнейшего использования. В случае успешного эксперимента от пяти до 10% от общего числа мышей будут иметь независимое рекомбинантное потомство. После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как осуществляются генетические процессы при малярии.

Паразит с добавлением среды yoi. Данный метод может быть в равной степени применим и к другим видам паразитов.