Изолированные сетчатки Подготовка к записи Света Ответ Генетически Маркированный ганглиозных клеток сетчатки

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы записать вызванные светом ответы генетически помеченных ганглиозных клеток в изолированной сетчатке мыши. Это достигается путем предварительного рассечения сетчатки от мышиного глаза. Вторым этапом процедуры является обработка сетчатки ферментом для удаления оставшегося стекловидного тела.

Третьим этапом процедуры является установка ганглиозных клеток сетчатки стороной вверх в записывающую камеру, установка камеры на предметный столик микроскопа и идентификация генетически помеченных ганглиозных клеток. Заключительным этапом процедуры является получение полной клеточной записи идентифицированной ганглиозной клетки и запись вызванных светом реакций. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают функциональные свойства определенной ганглиозной клетки, тип сетчатки мыши и определяют сигналы, которые она передает в мозг через записи с помощью зажима одноклеточного патча.

Здравствуйте, меня зовут Тиффани Шмидт, и я аспирант по нейробиологии в лаборатории доктора Пауло Ка Фудзи в Университете Миннесоты. Этот метод позволяет идентифицировать и записывать данные из определенной, генетически меченой популяции ганглиозных клеток и проводить последующий морфологический анализ. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области зрения, например, как различные подтипы ганглиозных клеток обрабатывают ключевые особенности визуальных стимулов до проведения операции.

Чтобы удалить сетчатку, первая задача состоит в том, чтобы перепутать восемь растворов, необходимых для эксперимента. Ингредиенты для всех растворов, использованных в этом эксперименте, приведены в сопроводительном тексте. Перенесите 200 миллилитров внеклеточного раствора в стакан объемом 250 миллилитров для хранения сетчатки глаза.

Поместите оставшийся внеклеточный раствор в разделительную воронку для усиления силы тяжести во время записи. Оба эти раствора должны постоянно поддерживаться в насыщенном кислороде на 95% и углекислом газе на 5%. Чтобы визуализировать дендриты во время эксперимента, добавьте во внутриклеточный раствор флуоресцентный индикатор, такой как LOR 5 94.

Если вы планируете проводить иммуногистохимию после полной регистрации клеток, добавьте во внутриклеточный раствор 0,3% нейробиотина. Как только необходимые растворы будут приготовлены, усыпьте мышь путем удушения углекислым газом, зародышев глазное яблоко, осторожно вставив под углом щипцы номер два позади глаза и приподняв глазное яблоко. С помощью офтальмологических ножниц очистите экстраокулярные мышцы и перережьте зрительный нерв.

Поместите глазное яблоко в 35-миллиметровую чашку Петри, наполненную внеклеточным раствором. Отрежьте роговицу офтальмологическими ножницами и вытащите хрусталик с помощью щипцов номер пять. Используйте щипцы номер пять, чтобы разорвать склеру и перерезать оставшийся зрительный нерв там, где встречаются сетчатка и склера.

Аккуратно оттяните сетчатку от наглазника, проведя щипцами в пространстве между сетчаткой и склерой. Чтобы сэкономить время, проделайте каждый шаг на обеих сетчатках Прежде чем перейти к следующему шагу, важным шагом является удаление стекловидного тела, прикрепленного к сетчатке. Начните с использования щипцов, чтобы захватить прозрачное стекловидное тело над сетчаткой.

Если стекловидное тело будет удалено успешно, вы увидите небольшое прозрачное студенистое вещество на кончике щипцов. Разрежьте каждую сетчатку пополам, чтобы максимально увеличить количество пригодной для использования ткани и облегчить установку сетчатки в камеру записи. Поместите сетчатку в насыщенный кислородом внеклеточный раствор при комнатной температуре и минимизируйте воздействие света, пропуская только минимальное количество окружающего света, такого как свет от экранов компьютеров, сетчатка останется жизнеспособной в течение примерно шести часов.

После вскрытия возьмите 500 микролитров внеклеточного раствора из раствора, в котором пузырится лишняя сетчатка. Разведите в него. Аликвота раствора фермента гиалуронидазы коллагеназы.

Поместите ферментный раствор в 35-миллиметровую чашку Петри и перенесите одну из рассеченных сетчаток в чашку Петри. Вращайте чашку Петри в течение 15 минут, все время аккуратно сливая 95% кислорода, 5% углекислого газа в растворе. Ферментный раствор удаляет остатки стекловидного тела и обеспечивает более легкий доступ к слою ганглиозных клеток Для сетчатки от молодых животных с меньшим стекловидным телом или при наблюдающихся побочных эффектах пищеварение может быть сокращено до пяти минут.

С помощью пластиковой переводной пипетки с отрезанным кончиком удалите сетчатку от среды, содержащей фермент. Обильно промойте сетчатку во внеклеточном растворе.

Перенесите сетчатку глаза в записывающую камеру. Повернув слой фоторецептора вниз, удалите остатки жидкости с помощью пипетки или салфетки и раскатайте боковые стороны сетчатки, чтобы сделать ткань плоской. Будьте осторожны, прикасайтесь только к краям сетчатки, а не к слою ганглиозных клеток.

Чтобы закрепить сетчатку, поместите на сетчатку платиновое кольцо с нейлоновой сеткой, а затем сразу же заполните камеру внеклеточным раствором. Установите записывающую камеру на предметный столик микроскопа, а затем прикрепите трубку для гравитационной перфузии внеклеточного раствора, вакуумную всасывающую трубку и провод заземления. Отрегулируйте гравитацию так, чтобы она капала со скоростью один миллилитр в минуту или быстрее.

Если скорость перфузии слишком медленная, ткань не будет достаточно насыщена кислородом, и синаптическая передача сигналов может быть нарушена. Следующим шагом является настройка электрода для записи всего клеточного патча. Выберите пипетку с сопротивлением в диапазоне от трех до пяти мегаом.

Наполните записывающую пипетку размороженной аликвотой внутриклеточного раствора и вставьте ее в держатель пипетки с помощью инфракрасной подсветки и дифференциального интерференционного контраста или оптики DIC под объективом 10-кратного увеличения. Визуализируйте сетчатку глаза и записывающую пипетку. Инфракрасный свет используется для минимизации воздействия видимого света на сетчатку и минимизации световой адаптации, переключения на объектив с 40-кратным увеличением и наложения электрода прямо над тканью.

Мышиная линия, используемая в этом исследовании, экспрессирует EGFP в своих ганглиозных клетках, и, таким образом, ганглиозные клетки видны при эпифлуоресценции. Микроскопия освещает сетчатку с помощью эпифлуоресценции с точностью до 480 нанометров. Если сетчатка здорова, должны быть видны отдельные ганглиозные клетки.

Нездоровая сетчатка будет иметь большие гранулированные ядра и должна быть отброшена. Выберите одну из флуоресцентных ганглиозных клеток для записи и с помощью лабораторной ленты отметьте выбранную ячейку на мониторе компьютера. Переключитесь на инфракрасную оптику так, чтобы было видно выбранное тело ганглиозной клетки.

Расположите записывающий электрод рядом с целевой ганглиозной клеткой. Очистите область, непосредственно закрывающую ячейку, слегка надавливая на запись. Давление электрода подается с помощью пластикового шприца объемом 12 куб. см, подключенного к держателю пипетки с полиэтиленовой трубкой на нулевом усилителе.

Любые смещения напряжения. Поместите электрод на выбранную ганглиозную клетку до тех пор, пока на поверхности клетки не появится ямочка. Когда усилитель находится в режиме зажима напряжения, подайте тестовый импульс и контролируйте ток, проходящий через пипетку.

Приложите отрицательное давление, чтобы создать уплотнение между электродом и ячейкой. Сбросьте отрицательное давление, когда уплотнение начнет формироваться, и подождите, пока удерживающий ток не станет указывать на гигаэлектрическое уплотнение между мембраной ячейки и пипеткой. Подавайте мягкие импульсы отрицательного давления до тех пор, пока не появятся емкостные переходные процессы, указывающие на то, что был получен режим записи всей ячейки, а затем ослабьте любое приложение давления.

Если сопротивление доступа превышает 30 мегаом, это часто может быть уменьшено дополнительными очень мягкими импульсами отрицательного давления. После того, как будет получен режим целой ячейки, выключите инфракрасный свет и накройте микроскоп черной тканью. Дайте клетке темнеть в течение пяти минут.

Через пять минут заготовка готова к записи. В режиме текущего зажима включите стимуляцию белым светом по всему полю и запишите реакцию ганглиозной клетки. Если ганглиозная клетка должна быть стимулирована несколько раз, сетчатке следует дать возможность адаптироваться в темноте по мере необходимости между стимуляциями.

Световой стимул также может быть модифицирован на этом этапе, чтобы включить в него узорчатые или хроматические стимулы, чтобы оценить свойства ответа ганглиозных клеток после регистрации, флуоресцентный индикатор во внутриклеточном растворе диффундирует к дендритам путем переключения между эпифлуоресценцией и инфракрасной оптикой ДВС. Индикатор может быть визуализирован в условиях эпифлуоресценции на 594 нанометрах, и вы можете исследовать дендриты, чтобы определить, включена ли ганглиозная клетка выключена или стратифицирована. Нейробиотин, который был добавлен во внутриклеточный раствор, диффундировал в ганглиозную клетку, и поэтому следующим шагом будет подготовка сетчатки к иммуногистохимии.

Осторожно втяните пипетку, чтобы свести к минимуму повреждение клеточной мембраны. Обратите внимание, что если вы записываете и заполняете только одну ганглиозную клетку сетчатки за препарат, вы можете затем установить специфические корреляции между записанной ганглиозной клеткой и ее подробной морфологией. Далее поместите сетчатку в раствор альдегида Paraform и зафиксируйте на ночь при температуре четыре градуса Цельсия после фиксации на ночь.

Промойте неподвижную сетчатку в PBS, делая не менее шести изменений раствора PBS в течение двух или более часов. После полоскания перенесите сетчатку в пластину с блокирующим раствором, положите пластину на шейкер и оставьте на два часа. При комнатной температуре замените блокирующий раствор раствором для лечения стрептококка, положите сетчатку обратно на шейкер и дайте ей инкубироваться в течение двух дней при четырех градусах Цельсия.

Через два дня промойте сетчатку в PBS, сделав шесть полосканий по 20 минут каждое, чтобы закрепить сетчатку. Поместите его ганглиозной клеткой вверх на предметное стекло с помощью векторного щита. Крышка монтажного носителя со стеклянной крышкой, скольжение и уплотнение лаком для ногтей, меченую ганглиозную клетку теперь можно рассмотреть под конфокальным микроскопом.

На этом рисунке показаны GFP-положительные ганглиозные клетки сетчатки, визуализированные при эпифлуоресцентном освещении с 40-кратным увеличением слева и при ДВС-освещении справа. Если сетчатка здорова и рассечение прошло успешно, отдельные ганглиозные клетки видны под ДВС-синдромом при большом увеличении. Нездоровая сетчатка будет иметь большие гранулированные ядра и должна быть отброшена.

На этом рисунке показан тип световой реакции, типичный для М-2 на стратификации чувствительных ганглиозных клеток сетчатки изнутри фотографий. В зависимости от типа ганглиозных клеток сетчатки, генетически меченых в данном препарате, свойства ответа будут различаться. Если синаптический ответ данной ганглиозной клетки не нарушен, то клетка должна реагировать при появлении света или компенсировать его потенциалами действия.

А в случае внутренне фоточувствительной ганглиозной клетки, устойчивой деполяризации, этот рисунок заполненной нейробиотином ганглиозной клетки показывает морфологию типичной М1 вне стратификации, внутренне светочувствительной ганглиозной клетки сетчатки. После регистрации всей клетки иммуногистохимия позволяет установить корреляцию между морфологией дендрита и электрофизиологической реакцией ганглиозных клеток сетчатки. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить о том, что сетчатка должна хорошо насыщаться кислородом и быстро перфузировать ткань, чтобы сохранить синаптические реакции.

Спасибо за просмотр этой демонстрации.