Изолированные сетчатки Подготовка к записи Света Ответ Генетически Маркированный ганглиозных клеток сетчатки

Общая цель данной процедуры — регистрация световых ответов генетически маркированных ганглионарных клеток в изолированной сетчатке мыши. Для этого сначала сетчатку отделяют от глаза мыши. На втором этапе процедуры сетчатку обрабатывают ферментом для удаления остатков стекловидного тела.

Третьим этапом процедуры является установка сетчатки в регистрирующую камеру слоем ганглионарных клеток вверх, закрепление камеры на предметном столике микроскопа и идентификация генетически маркированных ганглионарных клеток. Заключительным этапом процедуры является регистрация активности всей клетки идентифицированного ганглионарного нейрона и запись ответов, вызванных светом. В конечном итоге с помощью метода локального прижима мембраны (patch clamp) отдельной клетки можно получить данные, демонстрирующие функциональные свойства определенного типа ганглионарных клеток сетчатки мыши, и определить сигналы, которые эти клетки передают в мозг.

Здравствуйте, меня зовут Тиффани Шмидт, я аспирантка в области нейронаук в лаборатории доктора Пауло Ка Фуджи в Университете Миннесоты. Данный метод позволяет идентифицировать и регистрировать активность определенной популяции генетически маркированных ганглионарных клеток с последующим морфологическим анализом. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области зрительного восприятия, например, о том, как различные подтипы ганглионарных клеток обрабатывают основные характеристики зрительных стимулов перед проведением хирургического вмешательства.

Для удаления сетчатки первым делом необходимо приготовить восемь растворов, требуемых для эксперимента. Состав всех растворов, используемых в данном эксперименте, приведен в сопроводительном тексте. Перелейте 200 milliliters внеклеточного раствора в стакан объемом 250 milliliter для хранения сетчатки.

Поместите оставшийся внеклеточный раствор в делительную воронку для гравитационной перфузии во время регистрации. Оба этих раствора должны постоянно оставаться насыщенными смесью 95% кислорода и 5% углекислого газа. Для визуализации дендритов в ходе эксперимента добавьте в внутриклеточный раствор флуоресцентный трекер, например LOR 5 94.

Если вы планируете проводить иммуногистохимический анализ после регистрации потенциалов всего тела клетки, добавьте 0,3% neuro biotin во внутриклеточный раствор. После приготовления необходимых растворов усыпите мышь методом асфиксии углекислым газом, извлеките глазное яблоко, аккуратно введя изогнутый пинцет №2 за глаз и приподняв яблоко. С помощью офтальмологических ножниц удалите глазодвигательные мышцы и перережьте зрительный нерв.

Поместите глазное яблоко в чашку Петри диаметром 35 миллиметров, заполненную внеклеточным раствором. Удалите роговицу с помощью офтальмологических ножниц и извлеките хрусталик, используя пинцет № 5. С помощью пинцета № 5 надрежьте склеру и перережьте остаток зрительного нерва в месте соединения сетчатки и склеры.

Осторожно отделите сетчатку от глазного кубка, проводя пинцетом в пространстве между сетчаткой и склерой. Для экономии времени выполняйте каждый этап на обеих сетчатках. Перед переходом к следующему шагу крайне важно удалить стекловидное тело, прикрепленное к сетчатке. Начните с захвата прозрачного стекловидного тела над сетчаткой с помощью пинцета.

Если стекловидное тело удалено успешно, на кончике пинцета будет видна небольшая прозрачная гелеобразная субстанция. Разрежьте каждую сетчатку пополам, чтобы максимально увеличить количество пригодной для использования ткани и облегчить ее закрепление в регистрационной камере. Поместите сетчатки в оксигенированный внеклеточный раствор при комнатной температуре; при условии минимизации воздействия света (допускается только минимальное окружающее освещение, например, от экранов компьютеров) сетчатки остаются жизнеспособными в течение примерно шести часов.

После диссекции возьмите 500 µL внеклеточного раствора из того раствора, в котором находятся сетчатки. Добавьте в него аликвоту раствора ферментов коллагеназы и гиалуронидазы.

Поместите раствор фермента в чашку Петри диаметром 35 мм и перенесите одну из препарированных сетчаток в чашку. В течение 15 минут медленно вращайте чашку Петри, постоянно продувая раствор смесью 95% oxygen и 5% carbon dioxide. Раствор фермента удаляет остатки стекловидного тела и облегчает доступ к слою ганглионарных клеток. Для сетчаток молодых животных с меньшим количеством стекловидного тела или при возникновении нежелательных эффектов время обработки можно сократить до пяти минут.

Используя пластиковую трансфер-пипетку с обрезанным кончиком, извлеките сетчатку из среды, содержащей ферменты. Тщательно промойте сетчатку в внеклеточном растворе.

Перенесите сетчатку в регистрирующую камеру. Разместив слой фоторецепторов лицом вниз, удалите остатки жидкости с помощью пипетки или салфетки и разгладьте края сетчатки, чтобы ткань лежала ровно. Будьте осторожны, касаясь только краев сетчатки, чтобы не повредить слой ганглионарных клеток.

Для фиксации сетчатки поместите платиновое кольцо с нейлоновой сеткой поверх сетчатки, а затем немедленно заполните камеру внеклеточным раствором. Установите записывающую камеру на предметный столик микроскопа, затем подсоедините трубку для гравитационной перфузии внеклеточного раствора, трубку вакуумного отсоса и заземляющий провод. Отрегулируйте высоту подачи раствора так, чтобы скорость капельного введения составляла 1 мл в минуту или более.

Если скорость перфузии будет слишком низкой, ткани не обеспечат достаточный уровень оксигенации, что может привести к нарушению синаптической передачи. Следующим шагом является подготовка электрода для проведения метода patch-clamp в конфигурации «целая клетка» (whole-cell). Выберите пипетку с сопротивлением в диапазоне от трех до пяти МОм.

Заполните записывающую пипетку размороженной аликвотой внутриклеточного раствора и установите ее в держатель для пипетки, используя инфракрасное освещение и дифференциально-интерференционный контраст или оптику DIC под объективом 10 x. Визуализируйте сетчатку и записывающую пипетку. Для минимизации воздействия видимого света на сетчатку и уменьшения световой адаптации используется инфракрасный свет; переключитесь на объектив 40 x и переместите электрод в поле зрения непосредственно над тканью.

Линия мышей, использованная в данном исследовании, экспрессирует EGFP в ганглионарных клетках, благодаря чему эти клетки видны при эпифлуоресцентной микроскопии. Сетчатка освещается эпифлуоресцентным светом с длиной волны 480 nanometers. Если сетчатка здорова, отдельные ганглионарные клетки должны быть отчетливо видны.

Сетчатки с признаками патологии будут иметь крупные гранулярные ядра, такие образцы следует отбраковать. Выберите одну из флуоресцирующих ганглионарных клеток для регистрации и с помощью лабораторной ленты отметьте выбранную клетку на мониторе компьютера. Переключитесь на инфракрасную оптику, чтобы тело выбранной ганглионарной клетки стало видимым.

Расположите регистрирующий электрод рядом с целевой ганглионарной клеткой. Очистите область, непосредственно прилегающую к клетке, приложив к электроду осторожное положительное давление. Давление на электрод подается с помощью пластического шприца объемом 12 cc, подключенного к держателю пипетки полиэтиленовой трубкой при нулевом значении усилителя.

Любые смещения напряжения. Прижмите электрод к выбранной ганглионарной клетке до появления вмятины на поверхности клетки. Переведя усилитель в режим фиксации потенциала (voltage clamp), подайте тестовый импульс и контролируйте ток, проходящий через пипетку.

Создайте отрицательное давление, чтобы обеспечить герметичное соединение между электродом и клеткой. Снимите отрицательное давление, когда соединение начнет формироваться, и подождите, пока ток удержания не будет указывать на образование гигаомного электрического контакта (гигазапечатывания) между мембраной клетки и пипеткой. Применяйте осторожные импульсы отрицательного давления до появления емкостных переходных процессов, свидетельствующих о переходе в режим регистрации от всей клетки, после чего полностью прекратите подачу давления.

Если сопротивление доступа превышает 30 МОм, это часто можно исправить дополнительными очень осторожными импульсами отрицательного давления. После перехода в режим целого This-клетки выключите инфракрасный свет и накройте микроскоп черной тканью. Дайте клетке адаптироваться к темноте в течение пяти минут.

Через пять минут препарат готов к записи. В режиме фиксации тока (current clamp) включите стимуляцию полнопольным белым светом и запишите ответ ганглионарной клетки. Если ганглионарную клетку необходимо стимулировать несколько раз, между стимулами следует обеспечить необходимую темновую адаптацию сетчатки.

На этом этапе световой стимул также может быть изменен, чтобы включить структурированные или хроматические стимулы для оценки свойств отклика ганглионарных клеток; после регистрации переключение между эпифлуоресцентной и ИК-оптикой DIC позволит увидеть, что флуоресцентный трейсер из внутриклеточного раствора диффундировал в дендриты. Трейсер можно визуализировать при эпифлуоресценции на длине волны 594 нанометров, что позволяет изучить дендриты и определить, является ли ганглионарная клетка ON- OFF- или бистратифицированной. Нейробиотин, добавленный во внутриклеточный раствор, диффундировал в ганглионарную клетку, поэтому следующим шагом будет подготовка сетчатки к иммуногистохимическому анализу.

Осторожно извлеките пипетку, чтобы минимизировать повреждение клеточной мембраны. Обратите внимание, что если вы регистрируете и заполняете только одну ганглионарную клетку сетчатки на один препарат, вы сможете установить конкретные корреляции между зарегистрированной ганглионарной клеткой и ее детальной морфологией. Затем поместите сетчатку в раствор параформальдегида и фиксируйте в течение ночи при температуре 4 °C.

Промойте фиксированную сетчатку в PBS, заменив раствор PBS не менее шести раз в течение двух или более часов. После промывки перенесите сетчатку в планшет с блокирующим раствором, поместите планшет на шейкер и оставьте на два часа. При комнатной температуре замените блокирующий раствор раствором для выявления стрептавидина, снова поместите сетчатку на шейкер и инкубируйте в течение двух дней при температуре 4 °C.

Через два дня промойте сетчатку в PBS, выполнив шесть промывок по 20 минут каждая, для последующего крепления. Поместите сетчатку стороной ганглиозных клеток вверх на предметное стекло, используя Vector Shield. Закройте среду для монтажа предметным стеклом и загерметизируйте края лаком для ногтей; теперь меченые ганглиозные клетки можно исследовать с помощью конфокального микроскопа.

На этом рисунке показаны GFP-положительные ганглиозные клетки сетчатки, визуализированные при 40-кратном увеличении с использованием эпифлуоресцентного освещения (слева) и дифференциально-интерференционного контраста (DIC) (справа). Если сетчатка здорова и препарирование прошло успешно, при большом увеличении в режиме DIC видны отдельные ганглиозные клетки. Образцы с нездоровой сетчаткой характеризуются наличием крупных гранулированных ядер и должны быть отбракованы.

На этом рисунке показан тип светового ответа, типичный для M2-типа стратифицирующей внутренне фоточувствительной ганглионарной клетки сетчатки. В зависимости от типа генетически маркированной ганглионарной клетки сетчатки в конкретном препарате свойства ответа будут различаться. Если синаптический ответ данной ганглионарной клетки сохранен, то клетка должна реагировать потенциалами действия при включении или выключении света.

В случае внутренне светочувствительной ганглиозной клетки при устойчивой деполяризации на данном изображении ганглиозной клетки, заполненной нейробиотином, показана морфология типичной M1-off стратифицирующей внутренне светочувствительной ганглиозной клетки сетчатки. После регистрации отклика всей клетки иммуногистохимия позволяет сопоставить дендритную морфологию и электрофизиологический ответ ганглиозной клетки сетчатки. При выполнении этой процедуры важно не забывать оксигенировать лунку с сетчаткой и быстро перфузировать ткань для сохранения синаптических ответов.

Благодарим вас за просмотр этой демонстрации.