Криоконсервация корковые блоки ткани для генерации высоко обогащенного нейронных культур

Здравствуйте, меня зовут Алан, и я работаю в лаборатории доктора Хорни Лу в Калифорнийском университете в Ирвайне на кафедре нейробиологии и поведения. А меня зовут Боб. Сегодня доктор Харо покажет вам быстрый, эффективный и надежный протокол рутинной криоконсервации блоков кортикальной ткани для последующей дегенерации высококачественных первичных нейронных культур.

Итак, приступим. Очищенную и измельченную ткань загружают в криопробирки, содержащие 10% ТМСО. Замораживающая среда.

Криофлаконы загружаются в контейнер для заморозки и помещаются при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее чем на четыре часа. Затем замороженные криопробирки помещаются в жидкий азот для длительного хранения. Для культивирования AC криофлакон растапливают на теплой водяной бане и промывают теплым HBSS для удаления остатков ДМСО.

Свежий HBSS добавляется вместе с tryin dns для диссоциации, после чего добавляется DMM с 10% EBS. Чтобы остановить диссоциативную ферментативную активность, клетки раскручивают вниз, а гранулу ресуспендируют в свежем DMM плюс 10% EBS и наносят на предварительно покрытые полилизиновые чашки. Через 24 часа ДММ превращается в дополненную нейробазальную среду и выращивается в течение 10 дней.

В этом протоколе используется стальное лезвие бритвы для измельчения кортикальной ткани перед использованием. Бритва должна быть стерилизована в 70% этаноле в течение не менее двух часов. Один буферизованный раствор соли Хэнка HBSS создается путем разбавления 10-кратного исходного раствора в стерилизованной воде, затем один X-H-B-S-S затем выдерживается либо на льду, либо при четырех градусах Цельсия до обработки тканей.

Оксид диметилсульфа или ДМСО используется в качестве криозащиты в замораживающих средах. В этом протоколе используется 10% объема и объемное разбавление ДМСО в одном X-H-B-S-S-D-M-S-O должен полностью перемешаться перед хранением при четырех градусах Цельсия. Налген и контейнер для заморозки используются для контроля скорости замораживания образцов.

В контейнер для заморозки загружаются криофлаконы объемом 2,5 миллилитра, которые были предварительно промаркированы. Также хорошей идеей будет пометить сами контейнеры для заморозки, если у вас их несколько, и отметить соответствующий контейнер на желчи. Предварительно охлажденные на 10% ДМСО, замораживающие среды, а также контейнер для заморозки завозят в стерильный шкаф биологической безопасности.

Здесь в каждый из криопробирок медленно добавляется один миллилитр замораживающего материала Убедившись, что крышки надежно закреплены, поместите контейнер для заморозки с флаконами при температуре четыре градуса Цельсия не менее чем на два часа непосредственно перед обработкой тканей. Предварительно стерилизованное лезвие бритвы нужно тщательно промыть. Три, три минуты стирки.

Использование стерилизованной воды должно быть достаточным для удаления остатков этанола. Эта процедура стирки должна быть быстрой, так как бритва склонна к окислению от длительного погружения и стерильной воды. Перед чисткой салфетку следует положить на пакет со льдом.

Слегка промойте холодной жидкостью X-H-B-S-S, чтобы удалить свободно плавающий мусор. Стерилизованные иглы используются для очистки кусочков ткани от любых оставшихся оболочек и кровеносных сосудов. Необходимо соблюдать осторожность для сохранения структурной целостности ткани во время чистки.

По мере того, как это будет увеличиваться, эффективность измельчения чистой ткани будет заметно отличаться от сырой ткани, и большая часть оболочек или кровеносных сосудов должна быть удалена. После того, как салфетка очищена и прополосщена, можно приступать к измельчению. Важно делать аккуратные надрезы ткани, создавая блоки размером примерно в один миллиметр в кубе.

Блоки слишком большого уровня имеют меньший выход ячеек при размораживании. Однако более мелких блоков также следует избегать чрезмерной обработки. Измельченную ткань можно собрать с помощью автоматической пипетки и немного прохладной X-H-B-S-S.

Обязательно промойте посуду с помощью HBSS, чтобы восстановить всю собранную ткань. Затем ткань добавляется в большой объем в один X-H-B-S-S и опускается на дно, создавая свободно упакованную гранулу. Это позволяет удалить любой оставшийся мусор, который может присутствовать при оседании ткани в HBSS, извлечь ранее охлажденный контейнер для заморозки и криопробирки перед выделением ткани.

Обязательно откройте все флаконы, чтобы ускорить процесс заполнения ткани. Воздействие ДМСО при комнатной температуре должно быть ограничено не более чем 10 минутами. Рекомендуется работать с одним контейнером для заморозки за раз, пока не будут использованы все салфетки.

Начните отсасывать верхнюю часть рыхлой ткани, гранулируйте кукурузу как можно ближе к грануле, не нарушая ее. Затем наденьте наконечник с отверстием шириной 200 микролитров на пипетку. Не используйте отверстие с меньшим кончиком, так как это нарушит структуру блоков, идущих в нижнюю часть гранулы тканевого блока.

Набирают 200 микролитров ткани медленно. Добавьте эту салфетку в криопробирку и переходите к следующей, пока все флаконы не будут заполнены. Может понадобиться правило 10 минут.

Быстро поместите контейнер для заморозки в криопробирки в морозильную камеру при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее чем на четыре часа или на ночь, если время ограничено. По прошествии достаточного количества времени выньте контейнер для заморозки из морозильной камеры и как можно быстрее распределите криопробирки по криокамере. Поместите криобокс в стеллаж для ящиков с жидким азотом для длительного хранения.

Удалите криомерный материал из жидкого азота как можно быстрее, ограничив криобоксы Воздействие комнатной температуры быстро расплавит образец путем погружения в водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия. Всегда держите крышку над водой. Часто проверяйте и не оттаивайте до тех пор, пока не будет наблюдаться небольшой лед P.

Перед тем, как положить его в сейфовый шкаф, простерилизуйте крио мерилом с 70% этанолом. Приступайте к добавлению размороженной ткани в большой объем теплой одной X-H-B-S-S, если на стенках криомерца осталась ткань. Аккуратно собирается с помощью HBSS.

Однажды все ткани были собраны. Переверните трубку три-четыре раза и дайте ткани осесть на дно. Этот этап обеспечивает достаточное разбавление ДМСО.

Как только ткань осядет, аспирируйте как можно больше супернатина. Затем добавьте к этому 10 миллилитров теплого свежего одного X-H-B-S-S. Добавьте 300 микролитров 0,25% трипсина и 50 микролитров ДНК.

Приступайте к диссоциации ткани с легким взбалтыванием, создавая мутную клеточную суспензию после диссоциации ткани. Остановите ферментативную активность, добавив теплое сухое вещество и обогащенные 10% суспензии ЭПС центрирующихся клеток сыворотки крупного рогатого скота в дозе 1200 Г в течение пяти минут. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в свежем DMEM плюс 10% EBS и нанесите пластины с полилизиновым покрытием.

Дайте ячейкам прикрепиться к посуде на 30 минут. Затем замените носитель на свежий DM плюс 10% EBS. Через 24 часа замените содержащую ДМ среду нейробазальной средой с добавлением N 2 и B 27 и увеличивайте в течение 10 дней.

Мы только что подробно описали обширный, эффективный и надежный протокол с рутинным сохранением блоков кортикальной ткани. Так что удачи.