Манипуляции с клетками нервной пластинки с помощью внутриутробной наноинъекции в эмбриональной модели мыши

Обезопасьте беременную мышь под наркозом с открытой маткой, содержащей эмбрионы до нейруляции. На этой стадии нервная пластинка открыта и подвергается прямому воздействию амниотической жидкости.

Поместите выбранные эмбрионы на чашку Петри с эластичной мембраной, чтобы стабилизировать их. Обезопасьте эмбрионы и примените физиологический раствор для увлажнения.

Направьте ультразвуковой зонд на эмбрион и измерьте диаметр амниотической полости, чтобы рассчитать оптимальный объем инъекции.

Расположите наноинъекционную иглу, содержащую раствор лентивируса с высоким титром, над эмбрионом-мишенью под углом, близким к перпендикуляру.

Введите точный небольшой объем в амниотическую полость, аккуратно втяните иглу и извлеките ультразвуковой зонд.

Аккуратно протолкните эмбрионы обратно внутрь мыши.

Введенный лентивирус сливается с клетками нервной пластинки, высвобождая свой генетический материал, который подвергается обратной транскрипции в ДНК и интегрируется в геном хозяина.

Это позволяет стабильно манипулировать генами в клетках нервной пластинки, поддерживая потенциальное терапевтическое применение.

С помощью щипцов проведите ткань между эмбрионами и осторожно вытяните оба маточных рога из брюшной полости. Подсчитайте и пронумеруйте эмбрионы, либо от яичника к шейке матки, либо от шейки матки к яичнику, с обеих сторон.

Далее с помощью влажного ватного тампона аккуратно протолкните все эмбрионы обратно в брюшную полость, кроме первых трех, подлежащих введению. Затем поместите каплю PBS на эластичную мембрану, приклеенную к круглому центральному отверстию имеющейся в продаже модифицированной чашки Петри, и держите ее непосредственно над эмбрионами. Вставьте закрытые щипцы в разрез резинки, затем отпустите щипцы, чтобы открыть эластичный разрез, капая жидкость на эмбрионы.

С помощью щипцов протяните через резинку участок матки, соответствующий трем эмбрионам, и аккуратно прижмите чашку Петри к брюшку мыши. Используя четыре глиняные ножки, закрепите и закрепите чашку Петри над животом, чтобы уменьшить давление на мышь, а также снизить чувствительность визуализации к дыханию и сердцебиению мыши. Затем с помощью щипцов и влажного ватного тампона отрегулируйте матку и резинку, чтобы убедиться, что резинка плотно прилегает к коже мыши, предотвращая утечку PBS.

Затем, чтобы зафиксировать матку, нажмите на цилиндр из пластилина справа от эмбрионов или матки и добавьте PBS в чашку Петри до тех пор, пока эмбрионы и матка полностью не будут покрыты PBS. Чтобы облегчить запись инъекций, опустите ультразвуковой зонд в PBS и отрегулируйте мышь или хирургический стол так, чтобы первый эмбрион был выровнен с ультразвуковым датчиком. Просканируйте все три эмбриона и осмотрите амниотические полости.

Затем с помощью ультразвукового аппарата измерить диаметр амниотической полости, чтобы определить подходящий объем инъекции. С помощью контроллера впрыска установите определенные объемы впрыска и скорость впрыска на медленное значение со скоростью впрыска 23 нанолитра в секунду. После опускания иглы в PBS, используя основные колеса на рельсовой системе, нажмите Empty на контроллере наноинжектора до тех пор, пока жидкость не достигнет кончика иглы.

Затем извлеките иглу из PBS и нажмите кнопку Inject, чтобы убедиться, что вытекает капля примерно желаемого объема. Снова опустите иглу в PBS и переместите наноинъектор с колесом Y-плоскости на микроманипулятор, чтобы выровнять иглу с ультразвуковым зондом и эмбрионом. Отрегулируйте угол иглы с помощью колеса угла инъекции, чтобы обеспечить почти перпендикулярный угол инъекции относительно стенки матки.

Затем с помощью инъекционного колеса на микроманипуляторе одним движением ввести иглу в околоплодные воды. Если кончик иглы исчезает с ультразвукового изображения, переместите зонд вперед или назад, чтобы вернуть иглу в фокус. Затем введите желаемый объем, нажав Inject в течение соответствующего количества раз.

После введения необходимого объема подождите от 5 до 10 секунд, прежде чем втянуть иглу одним легким движением.

Далее поднимите ультразвуковой зонд и иглу из PBS с помощью микроманипулятора, поворачивая иглу в сторону оператора, чтобы избежать повреждений и травм.

С помощью щипцов поместите первый и второй эмбрионы обратно в брюшную полость, осторожно протолкнув их через резинку.

После того, как все эмбрионы с оптимальными амниотическими полостями были введены, аккуратно протолкните эмбрионы и матку обратно в брюшную полость мыши.