Анализ мРНК ядерного Кинетика Экспорт в клетках млекопитающих по Микроинъекция

Общая цель данной процедуры заключается в измерении кинетики ядерного экспорта мРНК в клетках млекопитающих. Это достигается путем микроинъекции мРНК или ДНК в ядра клеток культур тканей млекопитающих с последующей фиксацией образцов после различных периодов инкубации.

Затем мРНК окрашивают методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH). Заключительным этапом процедуры является получение изображений клеток и количественное определение интенсивности флуоресценции в цитоплазме и ядре. Таким образом, скорость экспорта мРНК можно измерить с помощью сочетания микроинъекций и флуоресцентной микроскопии.

Здравствуйте, я SRG AV из лаборатории Алекса Палаццо кафедры биохимии Университета Торонто. Я Стефан Тоски, также из лаборатории Палаццо. Я Эми из лаборатории Палаццо, а я Кхи Маха Дэвид из лаборатории Палаццо.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру введения мРНК в ядра клеток культур тканей млекопитающих методом микроинъекций. Мы также покажем, как окрасить мРНК с помощью флуоресцентной гибридизации in situ. Эти методы используются в нашей лаборатории для изучения кинетики ядерного экспорта мРНК в клетках млекопитающих.

Итак, приступим. Перед микроинъекцией разведите предварительно подготовленную плазмидную ДНК в инъекционном буфере до концентрации от 50 до 200 µg/mL. Затем добавьте в смесь Oregon Green 488 или OG, конъюгированный с декстраном 70 kDa, чтобы обеспечить возможность идентификации инъецированных клеток.

Конъюгированный с OG декстран поможет определить, какой объем жидкости был введен в ядро, а какой просочился в цитоплазму. Центрифугируйте образцы при 13 000 G и температуре четыре градуса Цельсия в течение не менее 20 минут, чтобы осадить любые твердые частицы, которые могут потенциально закупорить кончик иглы. Выберите линию клеток млекопитающих для микроинъекции на основании критериев, описанных в письменном протоколе.

Для данной демонстрационной серии используются семь клеток. Клетки высевают на промытые кислотой покровные стекла в чашки Петри диаметром 30 мм не менее чем за 24 часа до микроинъекции. В идеале на момент инъекции монослой клеток должен быть конфлюэнтным примерно на 70–90%; для облегчения идентификации инъецированных клеток перед инъекцией в монослое создают повреждение с помощью пластикового наконечника пипетки объемом 200 µL.

Сделайте перекрестный надрез на покровном стекле и оставьте клетки для восстановления в инкубаторе для культур тканей минимум на 15 минут перед инъекцией. Для микроинъекций используйте перевернутый микроскоп, установленный на пневматическом виброизоляционном столе, чтобы свести к минимуму вибрации, которые могут нарушить процесс микроинъекции. С помощью наконечника для нанесения геля аккуратно удалите примерно 1 µL с поверхности центрифугированного образца, чтобы не повредить осадок.

Введите кончик пипетки в заднюю часть готовой иглы для микроинъекций и выдавите жидкость. Жидкость будет втянута в кончик иглы за счет капиллярного эффекта. Мениск у самого кончика должен появиться в течение периода от 5 до 30 секунд.

Поместите заполненную жидкостью иглу в держатель и закрепите его в микроманипуляторе. Под углом 45 градусов визуализируйте иглу с помощью объектива 10 x и расположите ее в центре поля зрения вблизи фокальной плоскости. С помощью грубых ручек микроманипулятора выполните позиционирование; держатель соединен трубкой со стеклянным шприцем, который используется для создания давления, необходимого для выталкивания жидкости из кончика иглы.

Для поддержания стабильного давления шприц закрепляют на трубном зажиме. Используя две резиновые пробки и два металлических зажима, приподнимите иглу на несколько миллиметров, чтобы предотвратить ее повреждение на последующих этапах, после чего отодвиньте микроскоп назад. Затем увеличьте давление, нажав на поршень шприца.

от 0,5 до двух кубических сантиметров. Поместите чашку Петри с покровным стеклом, на котором находится поврежденный монослой. На смотровом столе отодвиньте микроскоп назад.

Переведите стойку в вертикальное положение, чтобы конденсатор выровнялся и игла могла войти в жидкость. Это следует делать осторожно, чтобы игла не сломалась о покровное стекло. Используя объектив 10x, определите центр перекрестного среза и расположите иглу над клетками, в которые будет производиться инъекция.

Увеличьте увеличение, переключившись на объектив 40 x. Затем опустите и центрируйте иглу с помощью ручек точной настройки на джойстике. Начните инъекцию в одном из углов перекрестия раны, опустив иглу до контакта с ядром.

После инъекции фазовая яркость клетки заметно изменяется. Продолжайте движение вдоль одного края перекрестия раны. Для легкой идентификации инъецированных клеток при визуализации крайне важно правильно отрегулировать давление инъекции для каждой иглы.

Давление должно быть достаточно высоким, чтобы пробить плазматическую и ядерную мембраны, но не настолько сильным, чтобы вызвать гибель клеток. Выполняйте микроинъекции в клетки вдоль края раны в течение определенного периода времени. При наличии навыка за этот интервал можно ввести содержимое в несколько сотен клеток.

При инъекции плазмидной ДНК перед фиксацией инкубируйте микроинъецированные клетки при 37 °C в инкубаторе для культур тканей в течение 20 минут, затем прекратите транскрипцию. Для этого обработайте клетки раствором α-амантина в ростовой среде в концентрации 1 µg/mL. Данная концентрация эффективно ингибирует транскрипцию с микроинъецированных плазмид.

Поместите клетки обратно в инкубатор и дайте им экспортировать вновь синтезированную мРНК. Одну и ту же иглу можно использовать повторно для инъекций в несколько покровных стекол. Однако иглу необходимо заменить при смене типа микроинъектируемой ДНК или РНК.

Кроме того, после извлечения иглы из стержня ее следует утилизировать для получения точных данных о кинетике ядерного экспорта мРНК. Отдельные образцы необходимо фиксировать через 0 минут, 15 минут, 30 минут, 60 минут и 120 минут. После обработки alpha manin в соответствующее время аспирируйте ростовую среду и дважды промойте клетки двумя миллилитрами раствора PBS.

Важно поддерживать покровные стекла влажными, сводя к минимуму время их пребывания вне жидкости. Зафиксируйте клетки, добавив 2 mL 4% альдегида в PBS, и инкубируйте их в течение не менее 15 минут при комнатной температуре. После повторной промывки фиксированных образцов дважды, пермеабилизуйте клетки, используя 2 mL 0.1% Triton X 100 в PBS; снова инкубируйте клетки в течение не менее 15 минут при комнатной температуре.

Наконец, промойте образцы еще дважды, чтобы подготовить их к гибридизации. Дважды промойте клетки промывочным буфером на основе 1X SSC раствора, содержащего от 25 до 60% формамида. Затем подготовьте камеру окрашивания для гибридизации, налив на дно чашки Петри диаметром 150 мм воду и поместив на поверхность воды кусочек парафильма.

Удалите воду, перевернув чашку, чтобы параформ закрепился на ее дне. Вручную удалите все пузырьки воздуха с каждого покровного стекла, предназначенного для окрашивания. Нанесите пипеткой капли гибридизационного раствора объемом 100 µL на параформ.

Обратите внимание, что количество формагеза следует оптимизировать для конкретного используемого белка рыб с помощью пинцета. Извлеките покровное стекло с фиксированными клетками из чашки Петри диаметром 30 мм. С помощью фильтровальной бумаги Whatman просушите обратную сторону покровного стекла и удалите излишки буфера с лицевой стороны, не допуская высыхания клеток.

Затем поместите покровное стекло лицевой стороной вниз на раствор с FISH-зондами. Повторите эту процедуру для каждого покровного стекла. После того как крышка камеры для окрашивания будет установлена на место, инкубируйте образцы от 5 до 18 часов при 37 °C.

Подготовьте несколько промывочных камер аналогично подготовке камеры для окрашивания. С помощью пипетки нанесите 1 мл промывочного буфера на парафильм промывочной камеры. После инкубации извлеките покровные стекла из камеры для окрашивания, нанеся 1 мл промывочного буфера. Жидкость должна затечь под каждый образец за счет капиллярного эффекта.

Затем с помощью пинцета снимите покровные стекла и поместите каждое из них в каплю промывочного буфера, выдержанную при комнатной температуре в течение пяти минут. Промойте каждое покровное стекло еще дважды, чтобы общее количество промывок для каждого стекла составило три. Пипеткой нанесите от 10 до 30 µL фиксирующего раствора с DAPI на предварительно промытый предметный слайд. На один слайд с помощью пинцета и фильтровальной бумаги Whatman можно поместить два покровных стекла.

Просушите обратную сторону покровных стекол и удалите излишки жидкости с лицевой стороны, не допуская высыхания образцов. Положите каждое покровное стекло лицевой стороной вниз на каплю фиксирующего раствора. Закрепленные образцы можно хранить при температуре 4 °C.

Здесь представлены эффекты альфа-мантина на транскрипцию инъецированной плазмидной ДНК в клетках фибробластов NIH 3T3, которые были предварительно обработаны альфа-мантином в различных концентрациях. В клетки была введена плазмидная ДНК TFL s delta i и конъюгированный с OG 70 кДа декстран. Каждая строка соответствует одному полю зрения, в котором были получены изображения OG 70 кДа декстрана и мРНК T uts delta I.

Очевидно, что высокие концентрации препарата полностью подавляли синтез транскрипта T UTS delta I, тогда как при более низких концентрациях этого не наблюдалось. Показана временная зависимость стоимости ядерного экспорта мРНК. В семь клеток вводили плазмидную ДНК T UTS delta i и конъюгированный с OG декстран массой 70 килдалтон.

Через 30 минут после инъекции клеток их подвергли воздействию альфа-мантина и инкубировали при 37 °C в течение 0 минут, 60 минут и 120 минут. Затем клетки фиксировали и окрашивали зондом к мРНК T UTS delta I, а также антителами к маркеру ЭПР trap alpha; каждая строка соответствует отдельному полю клеток.

Для получения информации о том, как количественно определить экспорт мРНК, пожалуйста, обратитесь к онлайн-тексту здесь. Временная точка 120 минут была увеличена. Чтобы продемонстрировать колокализацию мРНК TFS delta I в ЭР, показано совмещение мРНК T UTS delta I зеленым цветом и trap alpha красным цветом. Информация о том, как окрашивать мРНК совместно с белками, приведена в онлайн-тексте.

Мы только что продемонстрировали способ измерения кинетики ядерного экспорта мРНК с помощью микроинъекций. При выполнении этой процедуры важно помнить, что успешная микроинъекция требует надлежащей подготовки. Такие ключевые этапы, как подготовка образцов ДНК и РНК, вытягивание игл, юстировка оптического оборудования и устранение неполадок при микроинъекциях, описаны в нашем письменном протоколе.

При визуализации и анализе микроинъецированной мРНК важно, чтобы количественная оценка ограничивалась только теми клетками, в ядра которых было введено более 90% инъецируемого раствора. Успешность ядерной инъекции можно оценить по распределению органо-зеленого декстрана в ядре и цитоплазме. Дополнительную информацию по разработке зондов для рыб и использованию программного обеспечения для анализа изображений с целью изучения распределения мРНК в цитоплазме и ядре см. в нашем онлайн-протоколе.

На этом все. Спасибо за внимание и удачи в ваших экспериментах.