Введение самоорганизующихся пептидов и нервных клеток-предшественников для восстановления спинного мозга в модели крысы

Закрепите крысу под наркозом с травмой шейного отдела спинного мозга на стереотаксической раме.

Место поражения состоит из поврежденных аксонов и заполненных жидкостью полостей, окруженных инфильтрированными иммунными клетками, глиальными клетками и фибробластами, которые препятствуют росту аксонов и функциональному восстановлению.

Продезинфицируйте и надрежьте кожу над позвоночником. Рассеките мышцы, чтобы обнажить твердую мозговую оболочку, внешнюю оболочку спинного мозга.

Иссеките рубцовую ткань из твердой мозговой оболочки, чтобы выявить место поражения спинного мозга.

Расположите над очагом поражения микрошприц, содержащий самоорганизующиеся пептиды (САП), и

введите их в ядро поражения с одной стороны от средней линии.

Повторите впрыск с противоположной стороны для равномерного распределения.

Затем введите нейральные клетки-предшественники (NPC) в участки, окружающие поражение, избегая воспаленного ядра поражения, чтобы повысить выживаемость NPC.

После введения САП самоорганизуются в каркас, который имитирует внеклеточный матрикс и соединяет полости. Каркас поддерживает выживание NPC и его дифференцировку в нервные клетки для ремоделирования тканей.

Инъекция проводится через 14 дней после травмы спинного мозга. Перед началом операции приготовьте САП в концентрации 1% от массы на объем в стерильной воде и наполните раствором стеклянный капилляр размером 100 микрометров, прикрепленный к шприцу Гамильтона.

Прикрепите шприц Гамильтона к стереотаксической раме. После обезболивания крысы закрепите голову в стереотаксической рамке и продезинфицируйте место операции повидон-йодом и 70% спиртом, как и раньше. Еще раз, после вскрытия кожи, аккуратно рассеките пару позвоночных мышц и вставьте ретракторы.

С помощью скальпеля No 15 удалите рубцовую ткань из твердой мозговой оболочки и повторно обнажите место поражения. Затем с помощью кончика острой иглы осторожно раскройте твердую мозговую оболочку. Наконец, стереотаксически вставьте стеклянный капилляр на глубину двух миллиметров в травмированный спинной мозг и введите САП.

После введения САП дайте капилляру оставаться в месте инъекции в течение одной минуты перед удалением, чтобы дать возможность ткани растянуться для размещения введенного раствора. Затем повторите инъекцию на следующем участке. Здесь NPC были выделены из паравентрикулярной зоны взрослой красной мыши DS и культивированы в соответствии с ранее опубликованными методиками.

Непосредственно перед микроинъекцией разведите NPC в питательной среде до концентрации 50 умно-10 на треть живых клеток на микролитр для трансплантации клеток и загрузите в стеклянный капилляр на шприце Гамильтона. NPC вводятся сразу после введения SAP. Для этого необходимо ввести стеклянный капилляр шприца Гамильтона на 0,2 миллиметра ростраль от места травмы и на 1,5 миллиметра ниже тыльной поверхности спинного мозга.

Вводите два микролитра клеточной суспензии со скоростью около 0,5 микролитра в минуту. После завершения первой инъекции позвольте капилляру оставаться в спинном мозге в течение одной минуты, как и раньше. Затем втяните капилляр, переместите его на соседний участок и повторите процедуру инъекции. Подождав минуту, как и раньше, втяните капилляр и переместите его на два миллиметра к месту травмы.

Выполните два инъекции по два микролитра в это место.